osmotische Resistenz von Erythrozyten

Hier werden zunächst alle Artikel gesammelt, bis sie nach Qualitätskontrollen in die entsprechenden Foren verschoben werden.

Moderatoren: Moderatoren, Assistenten

Antworten
Benutzeravatar
lemmi
IllumiNobel-Gewinner 2012
Beiträge: 3686
Registriert: Freitag 6. Januar 2012, 09:25

osmotische Resistenz von Erythrozyten

Beitrag von lemmi »

Bestimmung der osmotischen Resistenz von Erythrozyten

Bringt man Zellen in ein hypoosmolares Medium, so dringt Wasser, dem osmotischen Gradienten folgend, durch die Membran in das innere der Zelle ein. Lebende Zellen können dem bis zu einem gewissen Grade aktiv entgegenwirken, indem sie die Wassermoleküle über Carrierproteine, die in der Zellemembran lokalisiert sind, wieder aus der Zelle ausschleusen. Ist der Einstrom vom Wasser jedoch größer als die Exportkapazität der Zelle, so schwillt diese an und bei einem bestimmten Punkt reißt die Zellmembran und Zytoplasma tritt aus - es kommt zur Lyse der Zelle.

An den Erythrozyten, den roten Blutzellen, wird dieser Vorgang Hämolyse genannt. Er lässt sich hier besonders gut beobachten und auch quantifizieren, denn das in den Zellen enthaltene Hämoglobin lässt sich gut photometrisch bestimmen. Blutserum hat eine Osmolalität von rund 300 mosmol/l. Gesunde Erythrozyten sind bis zu einer gewissen Grenze hämolyseresistent, wobei diese Eigenschaft auch eine Funktion der Zeit ist. Bei einigen krankhaften Veränderungen der Erythrozytenmembran ist die osmotische Resistenz vermindert, bei einigen wenigen auch erhöht. Die Bestimmung der osmotischen Erythrozytenresistenz ist daher ein klassisches diagnostisches Verfahren, das inzwischen durch weitere Methoden ergänzt aber immer noch angewandt wird.


Material/Geräte:

Messpipetten, Kolbenhubpipetten verschiedener Größe, kleine Reagenzgläser aus Kunststoff mit Stopfen, Zentrifuge, Pipetten, 1-cm-Photometerküvetten, Spektralphotometer, Messkolben 100 ml


Chemikalien:

Natriumchlorid

di-Natriumhydrogenphosphat, wasserfrei

Natriumdihydrogenphosphat, wasserfrei

Blutproben, mit EDTA oder Heparin-Natrium antikoaguliert Warnhinweis: b


Sicherheitshinweise:

Vorsicht beim Umgang mit potentiell infektiösem, biologischem Material! Handschuhe tragen!


Versuchsdurchführung:

Herstellung der gepufferten Kochsalzlösung:
Man löst 9,0 g Natriumchlorid, 1,37 g di-Natriumhydrogenphosphat und 0,19 g Natriumdihydrogenphosphat in ca. 80 ml Wasser und füllt im Messkolben auf 100,00 ml auf. Diese Stammlösung einspricht in ihrer Osmolalität einer Natriumchloridlösung von 10,0 % und ist praktisch unbegrenzt haltbar.
Zur Bestimmung der osmotischen Resistenz füllt man 10,0 ml Stammlösung im Messkolben mit abgekochtem Wasser auf 100,0 ml auf und erhält eine Lösung von 1,0 % NaCl. Diese wird dann – ebenfalls mit abgekochtem Wasser - sukzessive weiter auf folgende Konzentrationen verdünnt: 0,9% - 0,8% - 0,7% - 0,65 % - 0,6 % - 0,55 % - 0,5% - 0,45% - 0,4% - 0,3% - 0,2% - 0,1%.

Testansatz (beachte hierzu die Anmerkungen!):
In kleine, zuvor beschriftete Kunststoff-Reagenzgläser wurden je 2,0 ml der Lösungen pipettiert und 0,2 ml der gut gemischten Blutprobe zugegeben. Die Röhrchen wurden dann verschlossen, der Inhalt durch vorsichtiges Kippen gemischt und dann 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Anschließend wurde 6 Minuten scharf zentrifugiert (50.000 UpM) und der Überstand über dem Bodensatz mit einer Einmal-Kunststoffpipette vorsichtig in bereitgestellte, beschriftete Photomerterküvetten abpipettiert. Schon hier fiel ein deutlicher Unterschied der beiden untersuchten Blutproben auf. Die Messung erfolgte im Spektralphotometer bei 590 nm, wobei der Ansatz mit 0,9 % NaCl als Leerwert verwendet und das Photometer damit auf 100% Transmission justiert wurde. Die Extinktion des Ansatzes mit 0,1 % NaCl wurde gleich 100% Hämolyse gesetzt und dann die erhaltenen Extinktionswerte der einzelnen Küvetten in Prozent Hämolyse umgerechnet.

Mit Blutprobe 1 wurden folgende Werte erhalten:

Bild

Die Blutprobe 2 gab in der gleichen Versuchsanordnung folgende Werte:

Bild

Die Werte wurden dann graphisch aufgetragen. Der Normalbereich der osmotischen Erythrozytenresistenz wurde aus der Literatur [1] entnommen und grau schraffiert eingezeichnet.

Bild

Die Probe 1 liegt im normalen Bereich (Normakontrolle). Die Hämolyse beginnt bei einer NaCl-Konzentration von 0,5 % und ist bei 0,3 bis 0,2 % NaCl vollständig. Probe zwei zeigt eine deutlich verminderte osmotische Resistenz. Die Hämolyse beginnt hier bereits bei 0,8-0,7 % NaCl und ist schon bei 0,4 % NaCl vollständig. Es muss ein Membrandefekt der Erythroyzten vorliegen.

Anmerkungen:
Der hier beschriebene Versuch weicht in einigen Punkten von dem diagnostischen Standardverfahren ab, was auf einem Irrtum meinerseits beruht. Korrekterweise muss viel weniger Blut zu den einzelnen Kochsalzverdünnungen zugegeben werden, als hier geschehen – nämlich auf 5 ml Salzlösung jeweils nur 50 µl Blut. Die Extinktion ist dann bei 546 nm zu messen. Bei der von mir angewandten, zehnfach höheren, Blutmege war die Extinktion bei dieser Wellenlänge bereits bei 30 % Hämolyse unendlich groß, so dass die Aufnahme der Kurve nicht möglich war. Es wurde daher auf eine Wellenlänge ausgewichen, bei der sich auch in den vollständig hämolysierten Röhrchen noch eine von Unendlich verschiedene Extinktion messen ließ. Wie die Ergebnisse zeigen, hat der Versuch dennoch funktioniert und makroskopisch ist der Befund natürlich viel eindrücklicher als bei einer niedrigeren Blutmenge.
Ausserdem wird in der Originalvorschrift verlangt, 10 Minuten bei 1500 g zu zentrifugieren. Da ich nicht alle Röhrchen gleichzeitig in die Zentrifuge stellen konnte (sie fasst nur 8 Röhrchen auf einmal) habe ich kürzer zentrifugiert, um die Inkubationszeit der letzten vier Röhrchen (dafür habe ich die zwei Röhrchen mit der höchsten und der niedrigsten NaCl-Konzentration genommen, wo der Effekt der Inkubationszeit weniger stark ist) nicht zu sehr auszudehnen. Offenbar ist auch diese Zentrifugationszeit ausreichend.


Entsorgung:

Die Ansätze werden nach den Vorschriften für biologische Abfälle entsorgt.


Erklärungen:

Erythrozyten sind Zellen mit begrenzten Stoffwechselkapazitäten. Das liegt daran, dass sie keinen Zellkern besitzen und somit nicht in der Lage sind, neue Enzyme u.a. Eiweiße zu synthetisieren, denn dazu muss eine Transkription von genetischem Material stattfinden. Die Erythrozyten müssen also Zeit ihres Lebens (ca. 90 Tage) mit ihrer einmal gegebenen Enzymausstattung auskommen, was ihre Adaptationsmöglichkeiten an veränderte Umgebungsbedingungen einschränkt. Veränderungen der Membranzusammensetzung haben daher erhebliche Folgen. Die Erythrozytenmembran besteht wie bei allen tierischen Zellen aus einer Lipiddoppelschicht in die Proteinmoleküle eingelagert sind. Einige dieser Moleküle (Ankyrin, Spectrin, Bande-3-Protein und Protein 4.2) sind für die normale Form der Erythrozyten essenziell.
Physiologischerweise besitzen Erythrozyten eine bikonkave Form mit einem dickeren Rand und einem dünneren zentralen Teil. Daher sehen sie unter dem Mikroskop in der Kantenansicht (in einer Aufschwemmung in 0,9% NaCl) wie kleine Hanteln aus und im getrockneten, gefärbten Blutausstrich ist das Zentrum etwas heller gefärbt als der Rand.

Nun existiert eine Reihe von vererbten Störungen der Blutbildung bei denen der Gehalt eines der o.g. Membranproteine vermindert ist. Dieser Mangel hat eine Veränderung der Erythrozytenform zur Folge die unter dem phänotypischen Begriff der Sphärozytose zusammengefasst wird. Dabei haben die Erythrozyten statt der normalen bikonkaven eine mehr oder weniger runde, kugelförmige (sphärische) Gestalt. Sphärozyten lassen sich im gefärbten Blutausstrich erkennen, weil sie einen geringeren Durchmesser haben als normale Erythrozyten und im Gegensatz zu diesen im Zentrum sehr intensiv gefärbt sind. Sie sind wesentlich weniger verformbar – z.B. bei der Passage von feinen Kapillargefäßen - und viel anfälliger gegenüber Hämolyse als normale Erythrozyten. Sie werden daher in der Milz leicht abgebaut und haben eine deutlich verkürzte Lebensspanne, so dass eine Blutarmut durch erhöhten Abbau von roten Blutkörperchen, eine sogenannte hämolytische Anämie, resultiert. Die Kugelzellenanämie, wie der deutsche Name der Erkrankung lautet, kann individuell sehr verschieden stark ausgeprägt sein und wird in der überwiegenden Zahl der Fälle (> 75%) autosomal-dominant vererbt.

Die verminderte osmotische Resistenz der Erythrozyten beruht darauf, dass kugelige Zellen im Vergleich zu ihrer Oberfläche bereits ein maximales Volumen aufweisen. Während normale Erythrozyten durch ihre Scheibenform eine Volumenreserve besitzen und eine gewisse Schwellung tolerieren, lysieren Kugelzellen schon bei einer geringen Volumenzunahme. Der Grad der Lyse hängt von mehreren Faktoren ab. Um vergleichbare Ergebnisse zu erhalten müssen die Temperatur, die Inkubationszeit und der pH-Wert (die Salzlösung ist auf den pyhsiologischen pH des Blutplasmas von 7,4 gepfuffert, daher die Verdünnungen mit abgekochtem, CO2-freiem Wasser ansetzen!) eingehalten werden. Auch die untersuchte Blutprobe muss frisch sein, idealerweise nicht älter als 2 Stunden. Die osmotische Resistenz nimmt nach längerer Lagerung der Erythrozyten ab. An 12 Stunden bei 37 °C inkubiertem Blut kann eine leichte osmotische Resistenzminderung (bei leichterer Ausprägung der Kugelzellenanämie) besser sichtbar gemacht werden, als bei frischem Blut – allerdings ist auch der Normalbereich unter diesen Umständen breiter und unschärfer als sonst.

Die Bestimmung der osmotischen Resistenz ist nach wie vor ein wesentlicher Baustein zur Diagnose der Sphärozytose. Allerdings wird sie heute in der Regel in anderer Form durchgeführt: Es wird nicht eine abfallende Kochsalzkonzentration angewandt sondern es wird die Zeit gemessen, die vergeht bis in einem definiert hypotonen Medium 50 % der Erythrozyten lysiert sind. Zusätzlich werden duchflußzytometrische Verfahren angewandt, welche die Bindung eines Farbstoffes (Eosin-5-Maleimid) an die Ertyhrozytenmembran messen. Die Stärke der Farbstoffbindung korreliert mit der Dichte der o.g. Membranproteine. Weiter kann man die Proteine der Erythrozytenmembran elektrophoretisch trennen und ihre Konzentration durch Mitführen eines Standards bestimmen.

Die Kugelzellenanämie ist bei hellhäutigen Menschen die bei weitem häufigste angeborene hämolytische Anämie. Als Spätfolgen kann es zur Bildung von Gallensteinen (durch das Hämoglobin-Abbauprodukt Bilirubin), zu subjektiv störender Milzvergrößerung sowie zur Bildung von Herden blutbildenden Gewebes an unphysiologischen Stellen (z.B. in der Lunge - physiologischerweise im Knochenmark) und bei betroffenen Kindern zu Knochendeformitäten kommen, da der Körper die vermehrte Zerstörung der Erythrozyten durch eine vermehrte Neubildung derselben auszugleichen sucht. Die Therapie der Wahl besteht in der operativen Entfernung der Milz (Splenektomie). Dadurch werden die klinischen Erscheinungen der Sphärozytose beseitigt, während die Veränderungen der Erythrozyten natürlich bestehen bleiben. Eine Splenektomie ist mit einem gewissen Risiko für schwer verlaufende Infektionen verbunden, sollte daher nur in mindestens mittelschweren Fällen, nicht bei kleinen Kindern und nur nach umfangreichen vorherigen Impfungen gegen bestimmte Krankheitserreger (Pneumokokken, Meningokokken, Hämophilus) durchgeführt werden.


Literatur:

1. Huber H, Löffler H, Faber V (Hrsg.): Methoden der diagnostischen Hämatologei; Springer-Verlag Berlin – Heidelberg 1994; ISBN 3-540-57493-X: 1-4
2. Williams Hematology; 8th Edition 2011, Mc Graw Hill Medical; ISBN 978-0-07-162144-1: 626-634


Bilder:


Bild
Die vorbereiteten Röhrchen mit Salzlösung in fallender Konzentration


Bild
Die verwendete Zentrifuge


Bild

Bild
Normalblut nach Inkubation und Zentrifugation. Oben die Ansätze in den Röhrchen. Man beachte den von rechts nach links abnehmenden Bodensatz aus nicht lysierten Erythrozyten! Unten der in die Photometerküvetten abpipettierte Überstand


Bild

Bild
Gleicher Ansatz mit Blut eines Menschen mit Kugelzellenanämie. Die im Vergleich zum Normalbefund viel früher einsetzende Hämolyse ist deutlich sichtbar.


Bild
Photometrie (Bausch&Lomb Spectronic 20)


Bild
Kugelzellenanämie im Blutausstrich bei 650-facher Vergrößerung. Stern: normale Ertyhrozyten. Ausrufezeichen: Kugelzellen (nur einige sind markiert)
"Alles sollte so einfach wie möglich gemacht werden. Aber nicht einfacher."(A. Einstein 1871-1955)

"Wer nur Chemie versteht, versteht auch die nicht recht!" (G.C. Lichtenberg, 1742 - 1799)

"Die gefährlichste Weltanschauung ist die Weltanschauung der Leute, die die Welt nie gesehen haben." (Alexander v. Humboldt, 1769 - 1859)

Antworten