Einleitung:
Haematoxylin (Im Folgenden als H. bezeichnet) ist der wichtigste Farbstoff zur Gewebsdifferenzierung in der Hellfeld-Mikroskopie. Der Farbstoff wird auch heute noch grösstenteils durch die Extraktion aus Blauholz gewonnen. Entdeckt wurde es durch die Spanier während der Eroberung Mittelamerikas. Die Quelle ist ein immergrüner Strauch/Baum mit Wuchshöhen bis zu 10 Metern ( Wiki). Das essentielle ist das Kernholz von blutroter Färbung, welches das Haematoxylin enthält, gemäss Literatur zwischen 9 und 12%. Hier finden sich jedoch die üblichen Probleme der Sekundärliteratur, indem nicht klar ist, ob dieser Wert für das Holz an sich gilt oder für den handelsüblichen Extrakt. Das Holz wurde zu einem wichtigen Handelsgut, es wurde von der Hafenstadt Campeche (Mexico) aus nach Europa verschifft, deshalb auch der lateinische Name: Campechianum lignum concisum . Da die Blaufärbung mittels Hämatoxylin sehr beliebt war und beispielsweise England gegen 1750 bis zu 13 000 Tonnen pro Jahr importierte, mussten teilweise sogar Gesetze gegen die Einfuhr des Farbstoffes erlassen werden, um die einheimische Textilindustrie zu schützen. Heute wird Haematoxylin ( H.) entweder als Blauholz zur Färbung von Stoffen verwendet (Schulen, Hobby ), das Hauptanwendungsgebiet sind jedoch die mikroskopischen Färbungen. Wie alle Farbstoffe im Bereich der Mikroskopie hat H. seinen Preis. Aktuell kosten 100g der Substanz 1245.- SFr. ( EUR – 20%). Ich hatte bei meinem Chemikalienhändler eine Dose mit einem kg , sprich rund 12‘000 SFr. in der Hand. Wichtig daran ist, dass H. per se keine Färbewirkung zeigt. Die wird erst durch die Reifung des H. zu Haematein erreicht ( Oxidation) oder die Einwirkung bestimmter Metallsalze.
[/img]Quelle: http://www.rossleben2001.werner-knoben. ... node5.html
Fragestellung:
Nachdem ich fast per Zufall entdeckt habe, dass unsere Drogerie das Blauholz zu einem einigermassen vernünftigen Preis in hoher Qualität liefern kann, habe ich mir 1 kg davon bestellt, mit dem Ziel das H. zu extrahieren. Nach dem ersten Misserfolg der Extraktion aus dem Holz habe ich mir 4 Portionen Blauholzextrakt bestellt, um mir das relativ mühsame Auskochen und Einengen zu ersparen. Das Prinzip ist das gleiche. Ich bin der Überzeugung, dass mit etwas Aufwand Interessierte, die sich die Extremkosten für H. sparen möchten, die Darstellung für ihre Bedürfnisse erreichen können. Dieser Beitrag soll eine Anleitung zur Extraktion des Farbstoffes werden.
Geräte:
2x 2000 ml Bechergläser, Magnet-Heizrührer, Büchnertrichter, passende Rundfilter, Saugflasche, Bechergläser von 600 – 1000ml, sehr viel Haushaltspapier, pH- Meter
Chemikalien:
Blauholz, 1 kg oder 100g käuflicher Blauholzextrakt
Aqua dest. ( auf 1kg Blauholz ca. 6L )
HCl 32 %
ätzend
Durchführung:
Das Blauholz wird in 4 Portionen zu 250 g mit jeweils 1500 ml Aqua dest. während 2 h mässiggradig Ausgekocht ( leichtes blubbern). Gewisse Quellen empfehlen ein Kaltes ziehen lassen des Blauholzes im kalten Wasser vor der Heizphase, damit wird die Struktur des Kernholzes aufgelockert und der Ertrag soll etwas besser sein.
Der Extrakt ist wasserlöslich und problemlos auswaschbar, allerdings reagiert der Farbstoff an den Händen mit jedem Metallsalz, ist also eine ziemliche Sauerei, deshalb sehr viel Haushaltspapier!!
Ein initialer Versuch der Filtration war frustran, sowohl über schnelles Filterpapier wie auch über die Nutsche unter Sog bis 1 bar. Deshalb habe ich 4 Extrakte unter kontinuierlichem magnetischen Rühren auf 100 ml eingeengt.
Als 100 ml erreicht waren, war die weitere Einengung nicht mehr sinnvoll, weil der Rührfisch wie ein Irrer herumgespritzt hat. Will man das Haematoxylin aus dem selbst hergestellten Extrakt isolieren, kommt man nicht darum herum, diesen im Trockenschrank, sprich Backofen, bei 90 Grad ( H. zersetzt sich oberhalb 1400 C ) einzutrocknen, damit man dessen Gewicht bestimmen kann, dies ist wichtig für die folgenden Schritte. Sie entsprechen der Darstellung des Haematoxylins aus dem käuflichen Extrakt:
100g Extrakt werden in 122 ml Aqua dest. ( 45 Gew.%) auf dem Heizrührer bis zu sieden Erhitzt, dabei löst sich der Extrakt vollständig. Die siedende Lösung wird mit HCl 32% angesäuert bis pH 2 ( Wichtig, muss exakt sein) . Danach stellt man einen Niederschlag fest. Man lässt noch ein paar Minuten weiter sieden, damit die Fällung der organischen Anteile so vollständig wie möglich ist. Eine Lösung von 30 Gew.% wird bis pH 1,3 angesäuert.
Danach kommt das Ganze in den Freezer und wird auf 2 bis 50 C abgekühlt. Es folgt die Filtration über Nutsche unter Sog. Das Filtrat kann verworfen werden, es enthält praktisch kein H. mehr. Der Filterkuchen wird 150 - 200 ml Aqua dest. wieder auf 1000 C aufgeheizt. Danach abnutschen der heissen Flüssigkeit unter Sog. Das Filtrat wird nun nach kurzem Abkühlen wieder in den Freezer gestellt und belassen bis es durchgefrohren ist. Danach kommt es in den Kühlschrank bei 50 C. Nach ein paar Stunden erkennt man die Haematoxylinkristalle über der Mutterlauge. Wenn man konsequent bei 2 – 50 C bleibt kann die Mutterlauge dekantiert werden, Nachspülung mit Aqua dest. ca. 100 ml derselben Temperatur. Grössere amorphe Teile der Mutterlauge werden mit der Pinzette entfernt. Dieser Schritt wird nun 3-5 mal wiederholt, bis die Kristalle glasklar sind. Getrocknet wird im Exsikkator bei 0,2 bar Druck.
Das Resultat sind x g reines Haematoxylin mit einem Wert von y SFr. und ein Rohprodukt zur Färbung der Zellkerne in der Mikroskopie. Dazu wird das H. im Grammbereich benötigt.
Bilder:
In der Verpackung.
Der Extrakt beim Einengen
Die ersten Zeichen der Kristalle über der Mutterlauge bei 30 C
Nach dem zweiten Umkristallisieren, der Reinheitsgrad ist noch nicht optimal
Erklärung:
Haematoxylin ist sehr schlecht wasserlöslich ( 3g/l bei 200 C ). In Ethanol ist es mit 30- 40g/l bei 200 C, jedoch werden bei der primären Extraktion mit Ethanol viel mehr unerwünschte Nebensubstrate ebenfalls in den Extrakt gebracht, welche die Kristallisation des Produkts verhindern können. Aus genau diesem Grund wurde in dem US- Patent: 2.369.345: „ Method of Recovering Hematoxyline, R.L. Drew, 1945“, die Fällung dieser Nebenextrakte als Schlüssel zur Kristallisation des H. erkannt. Und dies wird mit der Ansäuerung des Extrakts erreicht, die wesentlichen Störfaktoren fallen aus. Das heisse Filtrat enthält das H., welches nur noch mehrfach konsequent bei 2- 50 C umkristallisiert werden muss. Man kann den residuellen Filtrationskuchen noch einmal mit Aqua dest. aufkochen, aber die persönliche Erfahrung zeigt, dass jeder Filter davon, auch unter Sog sofort vollgesetzt ist.
Was die Fällung mit Harnstoff anbelangt, hatte ich eine klare Nullnummer, auch fraktionierte Konzentrationen zeigten keine Kristallisation. Kommt hinzu, wenn der Harnstoff einmal drinn ist, dann kann man den Ansatz wegschütten, der ist auch bei den genannten Arbeitstemperaturen noch gut löslich. Die Extraktion mit Diethylether wäre sicher machbar, aber: H. ist in Diethylether fast so schlecht löslich wie in Aqua dest.. Aus diesem Grund braucht man grosse Mengen des Lösungsmittels, die man per Destillation rekuperieren muss. Nachdem ich denselben Liter Ether zum vierten mal redestilliert und wieder stabilisiert hatte, wurde ich es leid.
Das Prinzip der Fällung der Störfaktoren im Haematoxylinextrakt durch Ansäuerung , Filtration und anschliessender wiederholter Rekristallisation des H. ist eine zwar etwas arbeitsintensive, jedoch einfache und sichere Methode, Haematoxylin aus Blauholzextrakt herzustellen und auf alle Fälle für das Hobbylabor geeignet.
Der genaue Ertrag wird gemeldet, Produkt ist am trocknen.
. Und die Extrakte stehen in der Finsternis des Kellers. Leidglich der wässrige macht mir Sorgen wegen allfälligen Pilzbefalls, aber ich denke ich werde ihn morgen mit Gas aufkochen.
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ich habe das wirklich "nur so" eingestellt. Ich weiß nicht mehr, von welchem Patienten des Bild stammte - es ist wirklich nur um die Färbewirkung des Hämatoxylins zu demionstrieren - aber schwer krank war er wahrscheinlich nicht, wenn ich das heute so anschaue. Ich sehe übriigens nur 2 Mitosen im linken unteren Viertel des Bildes. Die kugelrunden Zellkerne mit dem groben Chromatin wie einn haufen Spaghetti, die vielleicht wie Prophasen aussehen, sind für Erythroblasten (Vorstufen der roten Blutkörperchen) ganz normal.