Versuch der photometrischen Bestimmung von Minoxidil

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lemmi
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Versuch der photometrischen Bestimmung von Minoxidil

Beitrag von lemmi »

Versuch der quantitativen Bestimmung von Minoxidil (photometrisch)

Minoxidil ist ein Pharmakon, das vor ca. 50 Jahren zur Behandlung des hohen Blutdrucks entwickelt wurde. Schon früh fiel eine Nebenwirkung auf: es kam zu vermehrtem Haarwachstum (Hirsutismus), was vor allem Frauen als sehr störend empfanden. Da die Substanz innerlich eingenommen auch aus anderen Gründen nicht gut verträglich ist, wird sie als Blutdruckmittel nur sehr selten angewandt. Aus der Nebenwirkung wurde dagegen eine Indikation: topische Formulationen von Minoxidil werden weltweit zur Behandlung des Haarausfalles angewandt.

Die folgende Versuchsbeschreibung entstand aus dem Auftrag eines Freundes, ein Minoxidil-haltiges Rezepturarzneimittel zu untersuchen, das nicht den gewünschten Erfolg hatte. Die Fragestellung bestand darin, festzustellen ob die auf dem Ettikett angegebene Zusammensetzung korrekt war:

Haarwasser Ettikett.jpg
Haarwasser Ettikett.jpg (67.16 KiB) 268 mal betrachtet
Abb.: Ettikett des Rezepturarzneimittels

Minoxidil ist ein Piperidin-Pyrimidin-Abkömmling.
Minoxidil.jpg
Minoxidil.jpg (11.02 KiB) 268 mal betrachtet
Im Arzneibuch wird eine Gehaltsbestimmung der Substanz mittels potentiometrischer Titration in wasserfreier Essigsäure angegeben. Dazu wäre es jedoch nötig, das Pharmakon quantitativ aus der Arzneizubereitung zu isolieren. Der Arzneibuchkommentar erwähnt, dass Minoxidil mit Kupfer(II)-Ionen einen grünen Komplex bildet, der zur photometrischen Bestimmung geeignet sein soll (λmax=368 nm). Weitere Angaben werden nicht gemacht. Eine der dort genannten Identitätsprüfungen gibt jedoch an, dass man “10 mg Minoxidil in 1 ml Methanol lösen und mit 0,1 ml 0,5 M Kupfersulfatlösung versetzen“ soll. Bei Zugabe von 0,1 ml Salzsäure 2N schlage die grüne Farbe in gelbgrün um. Ob sich die Photometrie auf den neutralen oder sauren Ansatz bezieht, ist nicht angegeben

Ausgehend von diesen spärlichen Angaben habe ich mich darangemacht, ein photometrisches Verfahren zur Bestimmung von Minoxidil in den in topischen Lösungen üblichen Konzentrationen (2-5%) auszuarbeiten.


Material/Geräte:

Messpipette 2 ml, Kolbenhubpipetten 200 und 100 µl, Messkolben 10 ml, kleine Probenröhrchen mit Stopfen (3 ml), Einmalkübvetten 1 cm, Photometer;
DC-Folie Sil G60 254F (8x4 cm), Entwicklungskammer, UV-Lampe


Chemikalien:

Methanol Warnhinweis: f Warnhinweis: t
Ethanol 50% Warnhinweis: f
Ammoniaklösung 25% Warnhinweis: c Warnhinweis: n Warnhinweis: t
Kupfer(II)-sulfat-Lösung 0,5M Warnhinweis: attn Warnhinweis: n
Salzsäure 2N Warnhinweis: c
Minoxidil Warnhinweis: attn


Versuchsdurchführung:

Zunächst wurde mittels DC überprüft, ob das zu analysierende Präparat überhaupt Minoxidil enthält. Dazu wurde es 1:25 mit Methanol verdünnt und 2 µl auf die DC-Folie aufgetragen. Als Referenz diente eine Lösung von 2 mg Minoxidil in 1 ml Methanol, als Laufmittel Methanol+Ammoniaklösung (10,0 + 0,15). Die Entwicklung der Folie nahm rund 15 Minuten in Anspruch, die Detektion geschah durch die Fluoreszenzminderung bei Bestrahlung mit kurzwelligem UV-Licht:

Haarwasser DC.jpg
Haarwasser DC.jpg (11.46 KiB) 268 mal betrachtet
Abb. DC-Folie: links Referenz, rechts verdünnte Probenlösung

Erste Photometrieversuche mit Kupfersulfat in salzsaurer, methanolischer Lösung ergaben, dass die entstehende Färbung nicht dem Lamber-Beer’schen Gesetz folgt.

Versuchsreihe 1.jpg
Abb: Minoxidil in je 2 ml Methanol mit 0,1 ml Kupfersulfatlösung und 0,1 ml Salzsäure

Zugehörige Messungen:
Tabelle 1.jpg
Ohne Salzsäurezusatz entstanden in wässriger oder methanolischer Lösung tiefgrüne Färbungen, wobei sich in Methanol bei Konzentrationen ab 10 mg/ml aufwärts grünbraune Niederschläge bildeten.

Versuchsreihe 2.jpg
Versuchsreihe 2.jpg (42.04 KiB) 268 mal betrachtet
Abb: Minoxidil in je 2 ml Methanol mit 0,1 ml Kupfersulfatlösung

Schließlich habe ich folgenden Ansatz verwendet: 2,0 ml Ethanol 50 % + 100 µl Analysenlösung + 200 µl Kupfersulfatlösung 0,5 M. Die Eichgerade wurde durch Einsatz von Minoxidil (gelöst in Methanol) fallender Konzentration an Stelle der Analysenlösung aufgestellt. Dabei bin ich von einer Lösung von 50 mg + 1000 µl Methanol ausgegangen. Diese ist eigentlich schon übersättigt (laut Arzneibuchkommentar lösen sich in 1 ml Methanol 44 mg Minoxidil) und der Versuch gelang vermutlich nur, weil die Raumtemperatur zum Zeitpunkt dieser Versuche 26 °C betrug. Als Leerwert diente eine Mischung aus 2,0 ml Ethanol 50%, 100 µl Methanol und 200 µl Kupfersulfatlösung.

Messreihe 2#.jpg
Messreihe 2#.jpg (43.88 KiB) 268 mal betrachtet
Abb.: Verdünnungsreihe

Die Messung bei 368 nm (Absorptionsmaximum) ergab bei 5 mg Minoxidil unmessbar hohe Extinktionen, es wurden daher schrittweise höhere Wellenlängen ausprobiert. Am besten waren die Ergebnisse bei 480 und 490 nm. Bei diesen Wellenlängen ist die Extinktion des Leerwertes (gegen reines Ethanol) kleiner als 0,01. Die folgende Tabelle zeigt die Messwerte:
Tabelle 2.jpg
(Anmerkung zu den “unmöglich exakt“ scheinenden Werten: ich habe die Intervalle zwischen den Markierungen der analogen Anzeige des Photometers in vier Teile geteilt, daher die Endungen auf “25“ und “75“!)

Folgende Eichkurven habe ich aufgestellt:
Eichkurve 480 nm.jpg
Eichkurve 480 nm.jpg (38.04 KiB) 265 mal betrachtet
Eichkurve 490 nm.jpg
Eichkurve 490 nm.jpg (35.42 KiB) 265 mal betrachtet

Entsorgung:

Die Photometerlösungen werden mit dem Schwermetallabfall entsorgt.


Überlegungen und Fragen:

Zur Konstitution des Minoxidil-Kupfer-Komplexes habe ich keine Angaben gefunden. Ich stelle mir folgenden Aufbau vor – in Analogie zu den anderen Kupferkomplexen in denen das Cu2+ mit vier Ligandenatomen und zusätzlich zwei Wassermolekülen koordiniert ist.
Minoxidil-Kupfer-Komplex.jpg
Minoxidil-Kupfer-Komplex.jpg (16.49 KiB) 268 mal betrachtet
Abb.: hypothetische Struktur des Minoxidil-Kupfer-Komplexes

Ob die beiden Aminogruppen am Pyrimidinring äquivalent sind? Oder spielt die Asymmetrie des Moleküls durch das zweite N-Atom im Ring eine Rolle?

Die analysierte Arzneimittelzubereitung enthält nach der ersten Messung (bei 480 nm) 4,58 mg/ml Minoxidil, bei der zweiten Messung (bei 490 nm) 4,66 mg/ml. Die Dichte der Analysenlösung (es wurden 1000 µl auf der analytischen Waage ausgewogen) betrug 0,885 g/ml. Rechnet man die Konzentration auf Massenprozente um (laut Zusammensetzung 5 % Minoxidil), so erhält man nach der ersten Messung 5,17 %, nach der zweiten Messung 5,26 %. Das Ergebnis ist also um etwa 4% zu hoch. Was kommt als Ursache in Frage?
Entweder die Lösung ist (es war nur ein Rest in der Flasche) etwas eingedunstet, oder der Apotheker hat nicht ganz korrekt gearbeitet – was eigentlich nicht passieren dürfte, jedenfalls nicht in dieser Größenordnung! – oder ein ganz anderer Faktor hat das Ergebnis der Messungen
beeinflusst. Kann es sein, dass die zugesetzten Hilfsstoffe (Propylenglycol, Macrogol-40-glycerolhydroxystearat, Isopropylpalmitat) Kupferionen komplexieren, und die Farbe beeinflussen so dass die Extinktion steigt? Leider habe ich keine der Substanzen verfügbar um das experimentell auszuprobieren.


Literatur:

Kommentar zum europäischen Arzneibuch, Artikel “Minoxidil“
"Alles sollte so einfach wie möglich gemacht werden. Aber nicht einfacher."(A. Einstein 1871-1955)

"Wer nur Chemie versteht, versteht auch die nicht recht!" (G.C. Lichtenberg, 1742 - 1799)

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Calciumcitrat
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Re: Versuch der photometrischen Bestimmung von Minoxidil

Beitrag von Calciumcitrat »

Ein schöner Versuch.

Ein paar Anmerkungen: Bei deinem Strukturvorschlag scheint das Kupfer ein Wassermolekül über das H zu koordinieren, das ist eher unüblich ;)

Die beiden Amine am Pyrimidin sind definitv nicht chemisch äquivalent. Über den Strukturvorschlag kann ich sonst wenig sagen, plausible ist er aber. Was passiert, wenn du nicht in Wasser, sondern in EtOH oder MeOH arbeitest (Das Glycol könnte das sonst nicht lösliche Kupfersulfat in Ethanol inLösung bringen, in Methano sollte es sich auch so lösen)? Propylenglycol könnte in der Lage sein, Kupferionen zu komplexieren und eventuell sogar zu reduziere, von anderen Polyolen ist das bekannt:

https://pubs.rsc.org/en/content/article ... ivAbstract
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2855589/
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs ... 9730920807

Oft wird hier aber im Basischen gearbeitet und vor Allem erhitzt.

Ansonten stört mich die Abwesenheit von Fehlerbalken und damit einhergehenden Fehlern in der Geradensteigung/Endergebnis. Hast du nur einmal alles gemessen? Vielleicht liegen 5% ja im Fehlerintervall...

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lemmi
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Re: Versuch der photometrischen Bestimmung von Minoxidil

Beitrag von lemmi »

Dass in der Formel die koordinationsbindungen am H des H2O enden ist nicht meine schuld sondern die von chem-sketch. Da ging das nicht anders :wink:

Die Messungen habe ich binnen einer halben Stunde mehrmals gemacht, um zu sehen ob die Extinktion über die Zeit stabil ist, allerdings an der selben Probe. Da waren die Abweicheungen praktisch null. Aber eine spektroskopische Methode die 5 % Fehelrbreite hat könnte man sowieso den Hasen geben. Gut, du hast natürlich Recht: da die Methode völlig neu ausgearbeitet wurde müsste ich schon die Kurven mehrere Male aufnehmen, um zu sehen, wie groß die Streubreite ist. Aber Lambert-Beer scheint so perfekt zuzutreffen, dass ich meine, die Resultate passen in diesen konkreten Fall (gleichzeitig angesetzte Referenz- und Analysenlösung, selbe Umgebungsbedingungen und Geräte etc.) schon ziemlich gut.
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Glaskocher
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Re: Versuch der photometrischen Bestimmung von Minoxidil

Beitrag von Glaskocher »

Um den Matrixeinfluß durch die Probe einschätzen zu können wäre eine aufgestockte Probe sinnvoll. Du wiegst etwas Reinsubstanz zu einer zweiten Probenverdünnung dazu und schaust mal, ob der Messwert nur um den zugewogenen Betrag verschoben ist, oder ob es da Abweichungen gibt. Sollte ein Matrixeinfluß erkennbar sein, dann müßte der aufgestockte Wert signifikant über- oder unterbewertet sein.

Da in der Flasche nur noch X Milliliter drin waren und sie geschätzt 300 minus X mal geöffnet wurde ist das Verdunsten von Ethanol plausibel. Allerdings weiß ich nicht, wie die sonstigen Bestandteile, speziell das Macrogol, sich auf die Farbe des Komplexes auswirken.

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mgritsch
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Re: Versuch der photometrischen Bestimmung von Minoxidil

Beitrag von mgritsch »

Sehr interessant, Methodenentwicklung hat immer einen ganz eigenen Reiz :) Warum nur Spielwiese?

Was ich mich frage: wie bist du auf die Wellenlängen gekommen?
Wie würden die UV-VIS-Spektren der Reinsubstanz bzw der Blindprobe und des Ansatzes mit Cu / HCl aussehen? Gibt es dort Peaks? Inwieweit überlappen die Peaks? Angesichts der einigermaßen genauen Nulldurchgänge der Kalibrationskurven vermutlich nicht.... (was ich erstaunlich finde). Bei einer Farbreaktion die eine grüne Farbe ergibt würde ich erwarten dass die Komplementärfarbe (Rot) absorbiert wird. Wenn Minoxidil im UV selbst ausgeprägte Banden hat wo es stark absorbiert braucht es evtl gar kein Cu odgl dazu?

Bisher hast du ja mal nur die Kalibrationskurve auf Basis deines Referenzprodukts gemessen, nehme an die Lösung des Rätsels ob der Freund im Produkt hat was drauf steht folgt noch... ;) Hoffen wir mal dass die anderen Zusatzstoffe nicht zu viel Interferenzen verursachen...

(p.s.: habe mir erlaubt dir mit den Chem- und G-Tags etwas behilflich zu sein ;) )
(p.p.s. was haben nur die Leute immer mit den Haaren. Entweder zu wenige oder zu viele, aber einfach zufrieden mit was auch immer da wächst ist wohl kaum wer...)

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lemmi
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Re: Versuch der photometrischen Bestimmung von Minoxidil

Beitrag von lemmi »

Danke für die Hilfe mit den chemtags, das hatte ich ganz verschwitzt 8)
[OT]gibts eigentllich eine Möglichkeit, griechische Buchstaben in den Text einzufügen? [\OT]

Die Messung des zu analysierenden Produkts habe ich schon beschrieben. Steht in der letzten Spalte der zweiten Tabelle und die Berechnung habe ich im letzten Abschnitt unter “Fragen“ diskutiert. Das Ergebnis lässt zwar noch einige methodische Fragen und bezüglich der analytischen Richtigkeit offen, eine so große Abweichung von der deklarierten Zusammensetzung, dass sie eine fehlende Wirkung erklären könnte, ist aber schon mal ausgeschlossen.

Ich habe das mal in die Spielwiese gestellt, weil es mir für einen Artikel nicht gut genug ist und ich nicht weiß, ob ich mich da wirklich so ausführlich reinhängen will, um es genau auszuarbeiten . Obwohl ich die Anregung von Glaskocher sehr gut finde, mal zu probieren was rauskommt, wenn man die Analysenlösung (mit denen eventuell störenden Zusätzen) zusammen mit der Referenzlösung mißt. Bei Gelegenheit probiere ich das mal aus.

Aber da gäbe es noch einiges zu optimieren. Schon die Herstellung der Referenzlösungen ist eine Herausforderung, weil Minoxidil in den meisten Lösungsmitteln einfach nicht gut genug löslich ist. Eine Absorptionskurve aufzunehmen war mir zu umständlich. Die Wellenlänge habe ich einfach durch Ausprobieren ermittelt, sodass am oberen Ende des Messbereichs (5mg Substanz) die Extinktion knapp über 0,5 und am unteren Ende des Bereichs (0,5 mg) noch ablesbar war.
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Glaskocher
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Re: Versuch der photometrischen Bestimmung von Minoxidil

Beitrag von Glaskocher »

[OT]Schau mal in der Kopfzeile der Smiley-Box nach ΑΒΓΔΕ αβγδε[/OT]

Calciumcitrat
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Re: Versuch der photometrischen Bestimmung von Minoxidil

Beitrag von Calciumcitrat »

Laut diesem Paper https://pubs.rsc.org/en/content/article ... ivAbstract, liegen die Absorptionsmaxima von Minoxidil bei pH 4 bei ca. 235 und 260 nm. Aber das hilft beim vorliegenden Kupferkomplex natürlich reichlich wenig...

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lemmi
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Re: Versuch der photometrischen Bestimmung von Minoxidil

Beitrag von lemmi »

Ich könnte natürlich das Minoxidil auch versuchen direkt zu messen, aber der Wellenlängenbereich den Du angibst ist ja schon kurzwelliges UV. Da braucht man vermutlich Quarzglasküvetten und außerdem bin ich mir nicht sicher ob mein Glühlampen-betriebenes Photometer das schafft.
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Re: Versuch der photometrischen Bestimmung von Minoxidil

Beitrag von mgritsch »

Uh ja, genauer bis zum Ende lesen hilft :)
lemmi hat geschrieben:
Mittwoch 9. September 2020, 16:09
Kann es sein, dass die zugesetzten Hilfsstoffe (Propylenglycol, Macrogol-40-glycerolhydroxystearat, Isopropylpalmitat) Kupferionen komplexieren, und die Farbe beeinflussen so dass die Extinktion steigt? Leider habe ich keine der Substanzen verfügbar um das experimentell auszuprobieren.
Komplexieren werden Diol bzw Polyether mit großer Wahrscheinlichkeit, die Frage ist inwieweit sie bzw die Komplexe bei der gemessenen Wellenlänge absorbieren, daher auch die Frage nach den einzelnen Spektren, dann könnte man das beurteilen.

Propylenglycol habe ich da, den Rest nicht, kann ich sonst gerne aufnehmen (190 - 900 nm), wenn du einschlägige Proben schickst auch gerne den Rest. Eine befreundete Apotheke gibt vielleicht auch kleinere Proben von Macrogol-40-glycerolhydroxystearat und Isopropylpalmitat für lau her?
Erste Photometrieversuche mit Kupfersulfat in salzsaurer, methanolischer Lösung ergaben, dass die entstehende Färbung nicht dem Lamber-Beer’schen Gesetz folgt. [...] Schließlich habe ich folgenden Ansatz verwendet: 2,0 ml Ethanol 50 % + 100 µl Analysenlösung + 200 µl Kupfersulfatlösung 0,5 M.
Eventuell wäre eine Pufferung gut um reproduzierbare Verhältnisse herzustellen?
Die Messung bei 368 nm (Absorptionsmaximum) ergab bei 5 mg Minoxidil unmessbar hohe Extinktionen, es wurden daher schrittweise höhere Wellenlängen ausprobiert.
während das Abweichen vom Maximum zwar technisch gesehen hilft auf eine niedrigere Extinktion zu kommen, bringt es potenziell Probleme mit sich. Solltest du in einer etwas steileren Flanke landen, erhältst du instabile Messwerte. Im Maximum der Absorption hast du tendenziell auch günstigere Verhältnisse zum Hintergrundsignal einer Matrix zu erwarten (wenn sie nicht justament gerade dort auch stark absorbiert...). So gesehen wäre evtl das Verdünnen der Probe (zB 1:10 mit EtOH?) und Messung im Maximum geeigneter. Definitiv sagen kann man das wenn man mal die Spektren der einzelnen Komponenten kennt :)

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lemmi
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Re: Versuch der photometrischen Bestimmung von Minoxidil

Beitrag von lemmi »

Danke für das Angebot die Spektren aufzunehmen. Proben der Substanezn müssten sich beschaffen lassen.
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