In diesem Artikel möchte ich einen kleinen Einblick in die histologische Arbeitsweise bieten und etwas zur Histologie der Leber beitragen. Von der Probenentnahme, über die Färbung, bis zum Einschluss als Dauerpräparat.
Geräte:
4 Bechergläser 100 ml, 1 Becherglas 250 ml, mehrere Schraubdeckeldosen 50 ml, Mikrotom, Mikrotom Einmalklingen, Mikroskop, Objektträger, Deckgläser, Magnetheizrührer mit Stativ, Thermometer, Pinzette, feine Pinsel, Präpariernadel Bunsenbrenner, Spatel, div. Pipetten, Wärmeschrank (muss 65°C erreichen können), Schweineleber, Pinzette, Streichholzschachtel, Bunsenbrenner, Hühner Eiklar
Chemikalien:
n-Butanol
Ethanol 96 %
Toluol
Isopropanol
Formalin 4 %
Salzsäure 33 %
Ammoniak 25 %
Eosin Y
Malinol
Hämatoxylin Lösung n. Ehrlich
Paraffin fest
Glycerin
Hinweis:
Beim Arbeiten mit Toluol und Formalin auf ausreichende Lüftung achten. Toluol kann auch problemlos durch Xylol ersetzt werden. Die verwendeten Farbstoffe färben sehr intensiv und vor allem Kleidung irreversibel.
Vorsicht beim Umgang mit Mikrotomklingen, sie schneiden Haut, Muskeln und Sehnen problemlos!
Durchführung:
Herstellung der benötigten Lösungen und der Objektträger
Für die Entwässerung der Gewebeprobe stellt man in 50 ml Schraubdeckeldosen unterschiedlich verdünnte Ethanol Lösungen her. Man benötigt jeweils 50 ml Ethanol 50 %, 75 %, und 85 %. Außerdem benötigt man eine gewichtsmäßige 1:1 Mischung aus Paraffin und n-Butanol, wobei das Paraffin bei Raumtemperatur zum größten Teil ungelöst bleibt. Man stellt den Wärmeschrank auf 65°C ein und stellt die Butanol-Paraffin Mischung und 3x je 50 ml Paraffin hinein. Da es teilweise sehr lange dauert bis das Paraffin bei 65°C geschmolzen ist, kann man das Paraffin im Wasserbad bei 100°C schnell schmelzen und es dann in den Wärmeschrank stellen und es auf 65°C abkühlen lassen. Achtung: die Butanol-Paraffin Mischung muss, sobald sie einmal geschmolzen ist und der Druck ausgeglichen ist, verschlossen in den Wärmeschrank gestellt werden. Es dürfen sich keine entzündlichen Butanol-Luft Gemische im Wärmeschrank ansammeln, da sonst Explosionsgefahr besteht!
Zur Durchführung der Hämatoxylin Färbung bereitet man in einem ersten 100 ml fassenden Becherglas 75 ml 50 % Ethanol vor, den man mit 3 Tropfen konzentrierter Salzsäure versetzt. In einem zweiten 100 ml Becherglas legt man 100 ml destilliertes Wasser vor und setzt 3 Tropfen konzentrierten Ammoniak zu.
Damit die später am Objektträger aufgebrachten Schnitte besser halten und nicht mehr so einfach abschwimmen können, bestreicht man die Objektträger mit einer dünnen Schicht Glycerineiweiß. Glycerineiweiß ist eine 1:1 Mischung aus Glycerin und Eiklar, dem 2 Tropfen 20 % Formalin zugesetzt werden. Man bereitet die Objektträger vor, indem man einen Einweghandschuh anzieht und mit dem Zeigefinger kurz das Glycerineiweiß berührt und es danach am Objektträger verstreicht, sodass ein dünner Film zurückbleibt.
Fixieren
Unter dem Begriff Fixierung versteht man im Prinzip das Haltbarmachen von biologischem Material. Es werden sämtliche Enzyme inaktiviert und somit wird verhindert, dass sich die Zellen zersetzen. Dieser Vorgang kann auf physikalischem (z.B. durch Kälte), als auch auf chemischem Weg erreicht werden. Die chemische Fixierung ist die gebräuchlichere und meistens wird dazu Formalin verwendet.
Man schneidet aus der Leber kleinere Stückchen raus und legt sie in 4 % Formalin. Man sollte die Gewebsstücke mindestens 24 Stunden fixieren, wenn sie größer sind entsprechend länger. Die Längere Aufbewahrung in Formalin schadet dem Gewebe für gewöhnlich nicht, es ist besser zu lange, als zu kurz zu fixieren.
Entwässern und Einbetten
Am Ende sollen die Gewebsstücke in Paraffin eingebettet werden. Dafür ist es notwendig sämtliches Wasser aus dem Gewebe zu entfernen und durch Paraffin mischbare Lösungsmittel zu ersetzen. Dazu nimmt man die fixierte Leber aus dem Formalin und schneidet sie in kleinere Stücke, ungefähr 5x5 mm und etwa 3 mm dick. Kleinere Stücke sind besser geeignet, da sie leichter zu schneiden sind. Man kann auch größere Stücke verwenden, die Dicke sollte aber 5 mm nicht überschreiten, damit die Entwässerung und das Einbetten nach folgender Vorschrift richtig funktionieren. Bei Dickeren Schnitten dringen die Lösungsmittel nach den angegeben Zeiten nicht mehr richtig ein.
Man führt folgende Schritte durch, wobei zwischen den Schritten das Gewebsstück mit etwas Küchenrolle abgetrocknet wird, um möglichst wenig Lösungsmittel in die nächste Stufe zu verschleppen (das bezieht sich nur auf die Stufen ohne Paraffin):
- 1 h Wasser
- 1 h 50 % Ethanol
- 1 h 75 % Ethanol
- 1 h 85 % Ethanol
- 1 h 96 % Ethanol
- 1 h 100 % Isopropanol
- 1 h 100 % Isopropanol
- 1 h 1:1 n-Butanol:Paraffin bei 65°C
- 1 h Paraffin bei 65°C
- 1 h Paraffin bei 65°C
- 1 h Paraffin bei 65°C
Man darf die Gewebsstücke nicht länger in den Alkoholstufen lassen, da das Gewebe sonst hart wird und ein Schneiden später unmöglich wird, da das Gewebe zersplittert.
Nach 11 Stunden nimmt man die letzte Paraffin Stufe aus dem Wärmeschrank, sie darf nicht mehr nach Butanol riechen, und gießt aus. Als Ausgussbehälter kann man einfach eine Streichholzschachtel verwenden, die man vorher mit einem Stück Kopierpapier ausgelegt hat. Mit einer im Wärmeschrank vorgewärmten Pinzette kann man die Gewebsstücke jetzt im flüssigen Paraffin zügig ausrichten. Danach lässt man das Paraffin im Kühlschrank härten. Gießt man gleich mehrere Gewebsstücke in einer größeren Streichholzschachtel ein, so muss man den Paraffinblock zerteilen, damit man später jedes Stück einzeln schneiden kann. Dafür lässt man das Paraffin für ungefähr 20 Minuten im Kühlschrank, sodass es zwar schon hart geworden ist, aber nicht komplett ausgehärtet ist, sodass man es noch leicht schneiden kann. Man entnimmt den Paraffinblock aus der Streichholzschachtel und entfernt das Kopierpapier vorsichtig. Der Paraffinblock muss schon soweit gehärtet sein, dass sich das Kopierpapier problemlos entfernen lässt, aber keine Risse entstehen. Jetzt kann man mit einer alten Mikrotomklinge den großen Paraffinblock der mehrere Gewebsstücke enthält, in einzelne, kleinere zerteilen. Die fertigen Blöckchen lässt man danach im Kühlschrank über Nacht fest werden. Es empfiehlt sich nicht im Gefrierschrank abzukühlen, da es sonst öfter zu Sprüngen im Paraffinblock kommt.
Befestigen und Schneiden
Dafür entnimmt man den Probenhalter und gießt etwas heißes Paraffin darauf. Danach nimmt man einen Spatel und erhitzt diesen über dem Bunsenbrenner. Den vorbereiteten Paraffinblock legt man auf den Probenhalter. Nun nimmt man den heißen Spatel und hebt den Paraffinblock leicht an und schiebt den heißen Spatel zwischen Paraffinblock und Paraffin des Probenhalters. Durch den heißen Spatel schmilzt das Paraffin auf dem Probenhalter und das Paraffin des Blocks in dem sich das Gewebsstück befindet. Man zieht den Spatel zügig heraus, wodurch der Paraffinblock auf dem Probenhalter aufgeschmolzen wird. Es wird die Seite des Paraffinblocks aufgeschmolzen, auf der das Gewebsstück nicht oberflächlich zu sehen ist. Man lässt das Paraffin für einige Minuten erstarren. Nun kann man den Probenhalter am Mikrotom einspannen und zum Schneiden beginnen.
Zuerst spannt man eine schon gebrauchte Mikrotomklinge ein und schneidet zügig in 25 μm Schritten, bis das Gewebsstück schön glatt angeschnitten ist. Danach wechselt man auf eine neue, oder kaum benutzte Klinge. Ab jetzt schneidet man in 5 μm Schritten weiter. Beim hier verwendeten Rotationsmikrotom bildet sich ein Band aus dünnen Paraffinschnitten, eine Schnittserie. Sobald man die Schnittserie mit einer Pinzette, oder einem Pinsel gut fassen und anheben kann, kann man die Schnittdicke noch schrittweise auf 3 μm verringern. Das Schneiden erfolgt zügig aber nicht unkontrolliert schnell und man sollte darauf achten, dass man die wachsende Schnittserie unter Zug hält, da sich die Schnitte sonst oft einfalten während des Schneidens.
Strecken und Aufziehen
Unter dem Strecken der Schnitte versteht man das "glattmachen" der Paraffinschnitte. Dazu bringt man die Paraffinschnitte vorsichtig mit einem Pinsel in ein 42°C warmes Wasserbad, wobei die glänzende Seite des Schnittes dem Wasser zugewandt wird. Durch die Oberflächenspannung und die Wärme breiten sich die Schnitte schön aus. Danach nimmt man einen vorbereiteten Objektträger und und fährt schräg unter den Schnitt und zieht ihn rasch auf. Danach lässt man überschüssiges Wasser abfließen und lässt den Objektträger trocknen. Dazu kann man den Objektträger mit dem Schnitt auf die Heizplatte legen, diese darf allerdings nicht so warm sein, dass das Paraffin zu schmelzen beginnt! Danach lässt man den Schnitt am Objektträger trocknen. Nachdem der Schnitt getrocknet ist erwärmt man den Objektträger auf der Heizplatte, sodass das Paraffin kurz etwas schmilzt. Jetzt sollte der Schnitt fest am Objektträger haften und später nicht mehr abschwimmen können.
Entparaffinieren, Färben, Entwässern und Eindecken
Bevor man das Gewebe färben kann, muss es wieder gewässert werden. Dazu geht man jetzt den umgekehrten Weg im Vergleich zur Entwässerung. Man taucht den Objektträger mit befestigtem Schnitt der Reihe nach je 3 Minuten in folgende Stufen:
- Toluol
- n-Butanol
- Isopropanol 100 %
- Ethanol 50 %
- Wasser
Danach überschichtet man den Schnitt mit einer Hämatoxylin-Lösung nach Ehrlich für 10 Minuten. Im Anschluss gießt man überschüssige Färbelösung ab und tauch den Objektträger in den anfangs vorbereiteten, mit Salzsäure angesäuerten Ethanol. Man taucht für ein paar Sekunden kurz ein, um überschüssiges Hämatoxylin zu entfernen, damit man eine selektive Kernfärbung erhält. Im Anschluss taucht man den Objektträger sofort in das vorbereitete ammonialkalische Wasser für 1 Minute. Der Schnitt färbt sich makroskopisch von rot zu blau. Diesen Prozess nennt man deshalb auch "Bläuen". Nach dem Bläuen wird vorsichtig mit Wasser gewaschen. Nun überschichtet man den Schnitt mit einer 1 % wässrigen Eosinlösung für 1 Minute. Nach 1 Minute wäscht man wieder gründlich mit Wasser ab. Danach spült man den Objektträger gründlich mit 96 % Ethanol ab, bis der abfließende Ethanol klar ist. Jetzt muss man wieder entwässern, da das Eindeckmittel nicht wasserverträglich ist. Dafür wird der Objektträger, nachdem mit 96 % Ethanol abgespült wurde, direkt in 100 % Isopropanol überführt. Nach 3 Minuten kommt der Objektträger für 3 Minuten in n-Butanol und danach für 3 Minuten in Toluol. Jetzt sollte der Schnitt wieder entwässert sein. Zwischen den einzelnen Stufen, sollte der Objektträger auf der Rückseite abgewischt werden, um möglichst wenig Lösungsmittel zu verschleppen. Danach taucht man eine Pasteurpipette in Malinol und tropft einen Tropfen Malinol direkt auf den Gewebsschnitt und legt ein Deckglas auf. Malinol ist ein in Xylol gelöstes Harz, ähnlich dem Kanadabalsam. Im Gegensatz zu Kanadabalsam wird es über die Jahre jedoch nicht sauer, und die Färbungen verblassen nicht, bzw. wesentlich weniger. Ein gut entwässertes Präparat ist viele Jahrzehnte haltbar.
Jedes Präparat sollte beschriftet werden, mit Inhalt, Färbung, Herstellungsdatum und Einschlussmittel. Die hergestellten Präparate sollten mindestens 1 Woche bei Zimmertemperatur getrocknet werden, bevor sie senkrecht gestellt werden. Malinol härtet relativ langsam und wenn man die Präparate zu früh aufstellt können die Deckgläser verrutschen.
Entsorgung:
Die verwendeten Lösungsmittel kommen zum halogenfreien Lösungsmittelabfall. Alle anderen Lösungen können verdünnt dem Abwasser beigegeben werden.
Erklärung:
Am Anfang eines histologischen Präparats stehen die Probennahme und die Fixierung. Durch das Formalin, werden zersetzende Enzyme inaktiviert und die Zellbestandteile werden haltbar gemacht. In dieser Präparation wurde eine gekaufte Schweineleber verwendet. Da die Leber natürlich nicht ganz frisch entnommen und fixiert wurde (sie lag wahrscheinlich mindestens schon mehrere Stunden gekühlt im Supermarkt), sind wahrscheinlich schon histologisch erkennbare Zersetzungserscheinungen eingetreten. So erkennt man teilweise sich ablösende Bindegewebszellen, das Bindegewebe als ganzes sieht teilweise schon etwas in Auflösung begriffen aus und auch in manchen Leberzellen kann man schon erkennen, dass die Integrität der Zelle nicht mehr gegeben ist. Im Großen und Ganzen sind das bei dieser Leber aber nur geringe Veränderungen und sonst sehen die Schnitte eigentlich noch sehr gut aus. Ich habe auch schon Lunge und Niere aus dem Supermarkt präpariert und in diesen Präparaten sieht man schon eindeutig absterbendes Gewebe und kaum noch gesunde Zellen und Strukturen. Die Leber hier macht vergleichsweise einen sehr frischen und gesunden Eindruck und man kann alle histologischen Strukturen schön erkennen.
Durch die schrittweise Entwässerung des Gewebes wird verhindert, dass die Zellen schrumpfen. Es ist nicht, oder nur unter Qualitätsverlust, möglich die Schnitte gleich aus Wasser in Isopropanol zu überführen. Isopropanol seinerseits ist gut mit Butanol-Paraffin mischbar und so ist es möglich das Wasser schrittweise durch Paraffin zu ersetzen, wodurch man schlussendlich in Paraffin einbetten kann. Es ist wichtig zu beachten, dass die Gewebsstücke nicht zu lange in den Alkoholstufen bleiben, vor allem Isopropanol und Butanol härten das Gewebe, wodurch es unschneidbar werden kann. Für kleine Stücke reicht eine Stunde pro Stufe bestens aus. Statt Butanol könnte an dieser Stelle auch Toluol, oder Xylol verwendet werden. In manchen Vorschriften findet man auch, dass Butanol überflüssig ist und man könnte statt einer warmen Paraffin-Butanol Mischung auch eine Paraffin-Isopropanol Mischung verwenden.
Das Schneiden am Mikrotom an sich erfordert einiges an Übung. Beim hier verwendeten Rotationsmikrotom wird durch Drehen des seitlichen Rades der Präparatehalter nach oben und unten bewegt, wobei bei jeder Drehung der Präparatehalter durch den eingestellten Abstand nach vorne geschoben wird. Dadurch kann man relativ einfach Schnittserien herstellen, was für manche Fragestellungen in der Histologie/Pathologie wichtig ist. Eine andere gängige Form eines Mikrotoms wäre das sogenannte Schlittenmikrotom, mit dem man jedoch keine Schnittserien anfertigen kann, dafür ermöglicht es einen ziehenden Schnitt. Ziehende Schnitte durch schräg gestellte Klingen bieten bei harten Proben einen Vorteil.
Die hier vorgestellte Hämatoxylin-Eosin Färbung ist die gängigste und am weitesten verbreitete Färbung. Hämatoxylin ist ein Naturstoff und kann aus der Rinde des Blauholzbaumes extrahiert werden (Haematoxylum campechianum). Hämatoxylin an sich färbt jedoch nicht, es muss erst zum Hämatein oxidiert werden. Dazu lässt man die Lösung an der Luft für einige Wochen reifen, oder man fügt etwas Kaliumiodat hinzu. Hämatein bildet mit Aluminium-Ionen einen positiv geladenen Komplex, der sich negativ geladenen Zellstrukturen anlagert. Dadurch werden alle negativ geladenen Zellstrukturen (vor allem die sauren Phosphat-Gruppen der Nukleinsäuren) zuerst rot gefärbt, da der Aluminium-Hämatein Komplex im leicht sauren Milieu der Färbelösung löslich ist. Durch das Überführen in leicht alkalisches Wasser fällt der Komplex als dunkelblauer bis violetter Lack aus. Damit nur die Strukturen gefärbt werden die auch negativ geladen sind und der Farbstoff nicht an falscher Stelle ausfällt ist es wichtig zu Differenzieren, indem man den Schnitt in salzsauren 50 % Ethanol überführt. In der Histologie bezeichnet man alle sauren Strukturen als basophil. Hämatoxylin ist ein basischer Farbstoff. Im Gegensatz zum Eosin, das sich bevorzugt an azidophile Strukturen, das sind vor allem basische Zellplasmaproteine, anlagert und dadurch das Zytoplasma rot färbt.
Malinol hat sich als Eindeckmittel bewährt da es kaum nachsäuert und einen sehr ähnlichen Brechungsindex wie Glas besitzt. Malinol härtet relativ langsam aus, deshalb sollte man die Präparate einige Wochen waagrecht lagern.
Bilder:
Das verwendete Rotationsmikrotom.
Das verwendete Stück Schweineleber.
Während des Schneidens.
Strecken der Schnitte im Wasserbad.
Entparaffinieren der Schnitte.
Die aufgezogenen Schnitte.
Während der Hämatoxylin Färbung.
Die Schnitte nach dem Bläuen. Unten am Objektträger erkennt man Farbstoffniederschlag der nachträglich entfernt wurde.
Während der Eosin Färbung.
Fertig eingedecktes Präparat; leider haben sich in diesem Fall ein Teil der Schnitte abgelöst beim Färben(Vorführeffekt).
Das fertige Präparat unter dem Mikroskop; da nicht mehr viel übrig war, zeige ich den Rest an einem zweiten Präparat.
Im Gegensatz zur Menschlichen Leber, weist die Schweineleber eine stärkere bindegwebige Septierung auf, wodurch man die annähernd sechseckigen Leberläppchen gut abgrenzen kann. In der Mitte eines jeden Leberläppchens erkennt man eine Lichtung, die Zentralvene (rote Kreise). An den Ecken wo mindestens 3 Leberläppchen aneinandergrenzen (grün), manchmal auch mehr, findet man die sogenannten Periportalfelder. Die Periportalfelder enthalten Bindegwebe und die Glisson-Trias. Die Glisson Trias bezeichnet 3 anatomische Strukturen, die sich in einem Periportalfeld finden:
- interlobulärer Gallengang (Ductus biliferi interlobulares ); die Leber produziert die Galle, die Gallenblase speichert diese lediglich.
- Arteria interlobularis (Zwischenlappenarterie); entstammt im weitesten Sinne aus der Bauchaorta
- Vena interlobularis (Zwischenlappenvene); entstammen aus der Pfortader (Vena portae)
In rot umkreist ist wieder eine Zentralvene; orange ist die Venenwand eingekreist; Wände von Venen sind meistens dünn und enthalten weniger Muskulatur als Arterien; schön zu erkennen sind die flachen Zellkerne der Endothelzellen (=flache Zellen, die die Innenseite der Blutgefäße auskleiden); zwischen den Leberzellen (Hepatozyten) erkennt man die Sinusoide, die in die Zentralvene münden; in ihnen erkennt man reichlich Erythrozyten.
Ein Periportalfeld; in blau zwei Venae interlobulares; in rot eine Arteria interlobularis die man an der wesentlich stärker ausgeprägten Muskulatur erkennt, die sie konzentrisch umgibt; in grün erkennt man einen Gallengang.
Zwei interlobuläre Gallengänge, oben ein kleinerer; interlobuläre Gallengänge erkennt man an ihrem hochprismatischem Epithel und den großen auf selber Höhe liegenden Zellkernen.
Größere Aufnahme der Arterie mit der sie umgebenden Muskulatur.
Nocheinmal eine Glisson-Trias; Vene in blau, Arterie in rot und Gallengänge in grün umkreist.
Anmerkung:
Man sieht in meinen Fotos immer wieder mal unschärfere Bereiche, was einerseits daran liegt, dass ich durch Okular fotografiert habe und andererseits, daran dass sich meine Schnitte leider nicht optimal gestreckt haben.
von einem 3µm Schnitt kann ich aber nur träumen.
) und wird in den pathologischen Instituten natürlich automatisiert durchgeführt. Auch die Leberhistologie ist schön beschrieben. Hast du auch Kupffer'sche Sternzellen (Lebermakrophagen) gesehen?
