Am Beispiel der Wurzelspitze der Küchenzwiebel (Allium cepa) möchte ich eine sehr schöne Anwendung des Feulgen'schen Reagenzes zeigen, das erlaubt selektiv Chromosomen zu färben. Außerdem wird etwas auf die Mitose und den Zellzyklus eingegangen.
Geräte:
Reagenzgläser, Uhrglas, Messzylinder, Bechergläser, Thermometer, Magnetheizrührer, Rührfisch, Pinzette, Präpariernadel, Rasierklinge, Pipetten, Küchenzwiebel (Allium cepa), Mikroskop, Objektträger, Deckglas, Wasser
Chemikalien:
Feulgen'sches Reagenz
Ethanol/Spiritus
Isopropanol
Eisessig
Salzsäure 1 M
Glyceringelatine nach Kaiser
Hinweis: Glyceringelatine nach Kaiser enthält Phenol und sollte deshalb nicht mit der Haut in Kontakt kommen.
Durchführung:
1. Gewinnung der Wurzelspitzen
Zu diesem Zweck besorgt man sich eine gewöhnliche Küchenzwiebel und platziert sie in einem Becherglas so, dass die Unterseite von Leitungswasser bedeckt ist. Nach einigen Tagen ist die Zwiebel ausgetrieben und man kann eine Wurzel entnehmen.
2. Präparation der Wurzelspitze
Mit einer Rasierklinge schneidet man die Wurzel längs durch. Von dem Längsschnitt wiederum schneidet man an der Wurzelspitze 3 mm der Wurzel ab und überträgt sie in Carnoysches Fixiergemisch (das Carnoysche Fixiergemisch besteht aus 3 Teilen Eisessig und einem Teil Ethanol). Man lässt die Wurzelspitze für 12 Stunden, am besten über Nacht, fixieren. Nach dem Fixieren wäscht man die Wurzelspitze mit Wasser. Dafür überführt man sie am besten mit einer Pipette aus dem Fixiergemisch in ein Uhrglas. Überschüssiges Fixiergemisch saugt man mit etwas Küchenpapier ab, danach füllt man wenig Wasser in das Uhrglas und spült die Wurzelspitze kurz ab. Nach dem Waschen saugt man das Wasser ab und pipettiert etwas 1 M Salzsäure in das Uhrglas. Im Anschluss baut man ein Wasserbad auf und stellt die Temperatur auf 60 °C ein. Im Wasserbad erwärmt man 1 M Salzsäure. Man überträgt die Wurzelspitze aus dem Uhrglas mit einer Pipette in die 1 M Salzsäure im Wasserbad und lässt sie dort für 15 Minuten. Nach 15 Minuten entnimmt man die Wurzelspitze und pipettiert sie wiederum in ein Uhrglas, saugt überschüssige Salzsäure ab und wäscht mit etwas Wasser. Danach saugt man das Wasser ab und ersetzt es durch Feulgen'sches Reagenz. Zum Färben übertragt man die Wurzelspitze in ein Schnappdeckelglas und überschichtet sie mit Feulgen'schem Reagenz. Das Schnappdeckelglas stellt man an einen lichtgeschützten Ort und lässt es für 1 Stunde stehen. Nach der 1 Stunde ist die Wurzelspitze nicht mehr weiß, sondern stark violett gefärbt. Man entnimmt sie mit einer Pipette, pipettiert sie in ein Uhrglas, saugt überschüssiges Feulgensches Reagenz ab und wäscht mit Wasser für 5 Minuten. Unterdessen entnimmt man mit einer Pipette ein kleines Stück Glyceringelatine nach Kaiser und übertragt es auf einen sauberen Objektträger. Den Objektträger mit der Glyceringelatine legt man vorsichtig auf die Heizplatte, die nicht zu heiß sein darf. Man nimmt ihn immer wieder ab, sodass er nur so warm wird, dass die Glyceringelatine schmilzt. Man kann zu diesem Zweck auch vorsichtig über einer sehr kleinen Bunsenbrennerflamme, oder mit einem Haartrockner arbeiten. Sobald die Glyceringelatine verflüssigt ist überträgt man die Wurzelspitze mit einer Präpariernadel aus dem Uhrglas in die Glyceringelatine. Nun setzt man in einem 45° Winkel ein Deckglas auf und legt es langsam auf die in der Glyceringelatine befindlichen Wurzelspitze, wobei man darauf achtet möglichst keine Luftblasen einzuschließen. Sobald das Deckglas drauf liegt quetscht man die Wurzelspitze vorsichtig. Dazu klopft man mit der Rückseite eines Bleistifts, oder einem ähnlichen Gegenstand auf das Deckglas. Dabei sollte das Deckglas möglichst nicht verrutschen, sondern nur gequetscht werden. Dazu kann man das Deckglas an einer Ecke mit dem Finger festhalten während man klopft. Da Glyceringelatine wegen ihres Phenolgehaltes giftig ist sollte man dazu Handschuhe verwenden. Man kann auch mit etwas Druck über das Deckglas streichen um die Wurzelspitze zu quetschen. Es ist empfehlenswert, während des Quetschvorgangs mit dem Mikroskop zu kontrollieren, ob man die Zellen schon gut genug erkennen kann. Danach lässt man die Glyceringelatine erhärten. Dafür legt man den Objektträger für 1 Stunde in den Kühlschrank. Hat man zu viel Glyceringelatine verwendet, quillt sie seitlich am Deckglas hervor. Nach dem Härten kann man sie abkratzen und Reste am besten mit etwas Isopropanol und einem Taschentuch vorsichtig entfernen. Vor allem das Deckglas muss sauber sein und darf keine Schlieren aufweisen. Danach kann man das Präparat unter dem Mikroskop betrachten.
Entsorgung:
Alle Lösungen können verdünnt dem Abwasser beigegeben werden. Die Küchenpapiere werden dem Hausmüll zugeführt.
Erklärung:
Der Mechanismus, der der Färbemethode zu Grunde liegt, wird hier beschrieben.
Der Aufbau einer Pflanzenwurzel ist im folgenden Bild gut ersichtlich. Die Zellteilungen finden im sogenanntem Meristem, dem Bildungsgewebe, statt, das in diesem Experiment präpariert wird.
Aufbau einer Wurzel1
Die DNA liegt im Zellkern aufgewickelt an sogenannten Histon-Proteinen vor, ähnlich einer Perlenschnur. Eine Einheit aus DNA und acht Histonen, um die die DNA gewickelt ist, bezeichnet man als Nucleosom. Die Nucleosomen werden mit weiteren Strukturproteinen zusammengepackt und bilden das Chromatin, aus dem die Chromosomen bestehen. Das Chromatin kann kondensiert, also verdichtet, oder dekondensiert, also unverdichtet vorliegen.
Metaphasen-Chromosom; allgemeiner Aufbau von Chromosomen.2
Die Mitose ist ein Stadium des während des Zellzyklus durchlaufen wird. Die G1-Phase findet direkt nach der Mitose, postmitotisch, statt und zeichnet sich hauptsächlich durch das Wachstum der Zellen und deren physiologische Funktion aus. Während dieser Phase liegt das Erbgut in Form von Ein-Chromatid-Chromosomen vor. Ein Chromatid ist die identische Längshälfte eines Chromosoms (siehe Abbildung). An die G1-Phase schließt sich die S-Phase an. Während der S-Phase, der Synthese-Phase, wird die DNA im Zellkern repliziert. Die Chromosomen liegen nach der Replikation als Zwei-Chromatid-Chromosomen vor, das sind Chromosomen die aus 2 identischen Schwesterchromatiden bestehen, die am Centromer zusammengehalten werden. Die Zelle muss sich jedoch nicht unbedingt teilen und kann statt in die S-Phase auch in die G0-Phase eintreten, in der sie einfach ihre Funktion erfüllt. Im Falle einer Zellteilung tritt die Zelle nach der S-Phase in die G2-Phase ein. In der G2-Phase trifft die Zelle alle Vorbereitungen für die anschließende Kernteilung. Die Interphase bezeichnet den Zeitraum vom Anfang G1-Phase bis zum Ende der G2-Phase. Im Anschluss an die G2-Phase erfolgt die Mitose, die M-Phase.
Ablauf des Zellzyklus3
Die Mitose wiederum gliedert sich in 4 Phasen und läuft in chronologischer Abfolge folgendermaßen ab:
1. Prophase: In der Prophase kondensiert die DNA und die Zwei-Chromatid-Chromosomen werden sichtbar.
2. Metaphase: Jetzt sind die Chromosomen am stärksten verkürzt und sie liegen in der sogenannten Metaphaseplatte. An das Centrosom der Zwei-Chromatid-Chromosomen docken die Mikrotubuli an. Mikrotubuli sind röhrenförmige Proteinfilamente, die einen Teil des Cytoskeletts bilden.
3. Anaphase: In der Anaphase werden die Chromatiden der Chromosomen getrennt, indem sich die Mikrotubuli verkürzen und die Chromosomen zu den entgegengesetzten Zellpolen gezogen werden. Ab jetzt liegt das Erbgut in Form von Ein-Chromatid-Chromosomen vor, bis die Zelle wieder in die S-Phase eintritt.
4. Telophase: Die Telophase ist die letzte Phase der Mitose. Die Mikrotubuli werden abgebaut und die Chromosomen dekondensieren wieder.
Im Anschluss an die Kernteilung findet die Cytokinese (Teilung des Zelleibs) statt.
Der Zellzyklus unterliegt strengen Kontrollmechanismen. Verschiedene Proteine regulieren den Zellzyklus und damit die Zellneubildung, die Proliferation. Durch Schäden an der DNA einer gesunden Zelle kann Expression dieser Proteine gestört werden, wodurch die Zelle ihr Wachstum nicht länger kontrollieren kann. Diese Entgleisungsmechanismen können, im Zusammenspiel mit anderen Faktoren, zur Tumorentstehung führen.
Bilder:
Da die Durchführung der Färbung nicht sehr spektakulär ist und im Grunde genauso abläuft wie bei der Feulgensches Nuclealreaktion, habe ich nur Bilder vom fertigen Präparat gemacht. Alle Bilder sind unter Ölimmersion bei 1000 facher Vergrößerung aufgenommen worden.
Abkürzungserläuterung für die folgenden Bilder:
I...Interphase
P...Prophase
M...Metaphase
A...Anaphase
T...Telophase
Man erkennt 2 Anaphasenstadien, ein Metaphasenstadium und Interphasenkerne. Schön zu sehen sind die Chromosomen und wie nur die Chromosomen selektiv gefärbt werden.
In der Prophase sind die Chromosomen schon kondensiert und gut von den Interphasekernen abzugrenzen.
Neben einem Anaphasenstadium kann man auf diesem Bild ein Telophasenstadium beobachten. Die Chromosomen der neuen Kerne dekondensieren, es ist aber noch eine gewisse Struktur erahnbar. Die Cytokinese hat noch nicht eingesetzt.
Hier sieht man ein Metaphasenstadium. Die Chromosomen sind in der Mitte der Zelle, der Metaphasenplatte angeordnet.
Noch ein Metaphasenstadium.
Dieses Bild zeigt eine frühe Anaphase. Die Chromatide werden getrennt.
Literatur:
Bruno P. Kremer: Das große Kosmos Buch der Mikroskopie, 3. Auflage, Stuttgart 2015; Franckh-Kosmos Verlags-GmbH & Co. KG
Alberts B. et al.: Lehrbuch der molekularen Zellbiologie; 2012 Weinheim, Wiley-VCN Verlag; ISBN 978-3-527-32824-6
Bildquellen:
1: http://www.spektrum.de/lexika/images/biok/f3f1026.jpg, 3. Jänner 2018
2: http://www.wie-funktioniert.com/wp-cont ... zyklus.jpg, 3. Jänner 2018
3: http://www.zum.de/Faecher/Materialien/b ... /chro3.jpg, 3. Jänner 2018
