Mit der Feulgenschen Nuclealreaktion, die auf dem Schiffschem Reagenz basiert, lässt sich DNA in Zellkernen selektiv und sehr gut anfärben. In diesem Artikel beschreibe ich die Herstellung des benötigten Reagenzes und färbe exemplarisch die Epidermis einer Zwiebel. Auf eine korrekte Fixierung wird hierbei verzichtet.
Geräte:
Magnetheizrührer, Thermometer, diverse Bechergläser, Filter und Filterpapier, Erlenmeyerkolben, Pipetten, Pinzette, Präpariernadel, Skalpell, Zwiebel, Wasser, Messzylinder, Waage, Braunglasflasche, Schnappdeckelgläser, Uhrglas, Objektträger, Deckglas, Mikroskop
Chemikalien:
Fuchsin
Kaliumdisulfit
Salzsäure 1 M
Ethanol 96% / Brennspiritus
Hinweis:
Die hergestellte Lösung färbt Haut und Stoff sehr intensiv. Fuchsin gilt als krebserregend. Es entstehen geringe Mengen Schwefeldioxid.
Durchführung:
1. Herstellung des Feulgen'schen Reagenzes
In einem 100 ml-Erlenmeyerkolben werden 0,5 g Kaliumdisulfit in 75 ml destilliertem Wasser gelöst. In einem 25 ml Becherglas werden 0,5 g Fuchsin in 15 ml 1 M Salzsäure gelöst und anschließend zu der Kaliumdisulfit Lösung gegeben. Das Becherglas mit verbleibendem Fuchsin wird mit weiteren 10 ml destilliertem Wasser ausgespült, um möglichst das gesamte Fuchsin zu lösen. Die 10 ml werden anschließend ebenfalls der Kaliumdisulfit Lösung zugegeben. Es bildet sich eine trübe, dunkelrote Flüssoigkeit. Die nun 100 ml des fertigen Reagenzes werden für 24 h im Dunklen stehen gelassen, wobei man den Kolben gelegentlich schwenkt. Nach 24 h kann filtriert werden. Die Lösung sollte sich wesentlich aufgehellt haben und hat jetzt eine leicht orange Färbung
Das fertige Reagenz sollte in einer Braunglasflasche möglichst kühl gelagert werden. Es ist nicht unbegrenzt haltbar.
2. Färbung der Zwiebelepidermis
Eine Zwiebel ist aus mehreren übereinanderliegenden Schuppen aufgebaut. Man entnimmt der Innenseite einer Zwiebelschuppe ein Stückchen der oberflächlichen Haut. Dazu ritzt man an der Oberfläche mit einer scharfen Klinge ein kleines Quadrat und zieht mit einer Pinzette vorsichtig die Epidermis ab. Diese wird daraufhin für 10 Minuten in 96% Ethanol gelegt. Währenddessen erwärmt man in einem Wasserbad 1 M Salzsäure auf 60 °C. Auf einem Magnetheizrührer füllt man ein Becherglas mit Wasser in welches ein Thermometer ragt und erhitzt unter Rühren. In das 60°C warme Wasser taucht man ein Tablettenglas, das mit 1 M Salzsäure befüllt ist. Vorsichtig wird die Zwiebelepidermis aus dem Ethanol genommen und für 12 Minuten in der 60 °C warmen Salzsäure gelassen. Danach wird die Zwiebelepidermis entnommen und kurz in einem Uhrglas mit etwas destilliertem Wasser abgespült. Nach kurzem Waschen wird die Zwiebelepidermis in das hergestellte Feulgensche Reagenz überführt und für 1 h im Dunklen aufbewahrt. Danach ist die Färbung abgeschlossen und die Zwiebelepidermis wird zuerst erneut mit destilliertem Wasser gewaschen und danach für 5 Minuten in 96% Ethanol eingelegt. Die Zwiebelepidermis besitzt jetzt bereits einen rosaroten Farbton. Im Anschluss wird sie auf einen Objektträger überführt, 1 Tropfen Wasser aufgetropft und vorsichtig ein Deckglas aufgelegt. Jetzt kann das Präparat unter dem Mikroskop betrachtet werden.
Anmerkungen:
Das Reagenz ist, wie bereits angemerkt, nicht unbegrenzt haltbar und sollte kühl und dunkel gelagert werden. Sobald das Reagenz einen Rotstich aufweist ist es unbrauchbar.
Gewebe werden vor dem Färben sonst meist fixiert, worauf ich hier verzichtet habe, da es bei diesem simplen Präparat, nicht notwendig ist.
Auch die Einwirkzeit des Feulgen'schen Reagenzes variiert von Präparat zu Präparat, liegt jedoch normalerweise zwischen 30 Minuten und 4 Stunden.
Entsorgung:
Alle Lösungen können verdünnt und neutralisiert dem Abwasser beigegeben werden.
Erklärung:
Fuchsin ist ein Triphenylmethanfarbstoff und enthält immer auch etwas Parafuchsin. In Wasser ist der grünlich glänzende Feststoff eher schlecht löslich. Er löst sich i verdünnter Säure unter tiefrotvioletter Farbe. Zusammen mit Kaliumdisulfit bildet Fuchsin in Salzsäure, die Fuchsinschweflige Säure. Die Fuchsinschweflige Säure, die an sich farblos ist, bindet Aldehyde, wodurch die intensive Färbung rückgebildet wird. Diese Reaktion macht man sich zunutze um Zellkerne und Chromosomen intensiv anzufärben.
In der DNA werden durch die Behandlung mit Salzsäure die N-glycosidischen Bindungen der Purinbasen zum C1-Atom der 2-Desoxyribose hydrolysiert, wodurch es zur Bildung der apurinischen Säure kommt. Nun kann die Fuchsinschweflige Säure mit der Aldehydgruppe der offenkettigen Desoxyribose reagieren, wodurch die intensive violette Farbe des Fuchsins rückgebildet wird. Dadurch kommt es selektiv zur Anfärbung der DNA/Chromosomen.
Bilder:
Die Ausgangsmaterialien zur Herstellung des Feulgenschen Reagenz. Da ich die Lösung bereits am Vortag hergestellt habe existieren keine Bilder von der Herstellung.
Die Lösung nach 24 Stunden vor dem Filtrieren. Sie erscheint auf dem Bild etwas dunkler als in echt.
Die Zwiebelepidermis in der Salzsäure im Wasserbad.
Waschen der Zwiebelepidermis nach der Hydrolyse in Salzsäure. Im Schnappdeckelglas befindet sich das filtrierte Feulgensche Reagenz.
Fertig gefärbtes Präparat. Man erkennt die Zellkerne als scharf abgegrenzte, dunkelviolette Struktur in den Zellkernen.
Quellen:
Bruno P. Kremer: Das große Kosmos Buch der Mikroskopie; Kosmos Verlag
http://flexikon.doccheck.com/de/Feulgen-F%C3%A4rbung
http://www.chemgapedia.de/vsengine/vlu/ ... vscml.html
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