Feulgensche Nuclealreaktion

Interessante Versuche aus der Biologie, Biochemie und Biotechnologie.

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Alf
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Feulgensche Nuclealreaktion

Beitrag von Alf »

Feulgensche Nuclealreaktion


Mit der Feulgenschen Nuclealreaktion, die auf dem Schiffschem Reagenz basiert, lässt sich DNA in Zellkernen selektiv und sehr gut anfärben. In diesem Artikel beschreibe ich die Herstellung des benötigten Reagenzes und färbe exemplarisch die Epidermis einer Zwiebel. Auf eine korrekte Fixierung wird hierbei verzichtet.


Geräte:

Magnetheizrührer, Thermometer, diverse Bechergläser, Filter und Filterpapier, Erlenmeyerkolben, Pipetten, Pinzette, Präpariernadel, Skalpell, Zwiebel, Wasser, Messzylinder, Waage, Braunglasflasche, Schnappdeckelgläser, Uhrglas, Objektträger, Deckglas, Mikroskop


Chemikalien:

Fuchsin Warnhinweis: attnWarnhinweis: xn
Kaliumdisulfit Warnhinweis: cWarnhinweis: attn
Salzsäure 1 M Warnhinweis: cWarnhinweis: attn
Ethanol 96% / Brennspiritus Warnhinweis: fWarnhinweis: attn

Hinweis:

Die hergestellte Lösung färbt Haut und Stoff sehr intensiv. Fuchsin gilt als krebserregend. Es entstehen geringe Mengen Schwefeldioxid.


Durchführung:

1. Herstellung des Feulgen'schen Reagenzes

In einem 100 ml-Erlenmeyerkolben werden 0,5 g Kaliumdisulfit in 75 ml destilliertem Wasser gelöst. In einem 25 ml Becherglas werden 0,5 g Fuchsin in 15 ml 1 M Salzsäure gelöst und anschließend zu der Kaliumdisulfit Lösung gegeben. Das Becherglas mit verbleibendem Fuchsin wird mit weiteren 10 ml destilliertem Wasser ausgespült, um möglichst das gesamte Fuchsin zu lösen. Die 10 ml werden anschließend ebenfalls der Kaliumdisulfit Lösung zugegeben. Es bildet sich eine trübe, dunkelrote Flüssoigkeit. Die nun 100 ml des fertigen Reagenzes werden für 24 h im Dunklen stehen gelassen, wobei man den Kolben gelegentlich schwenkt. Nach 24 h kann filtriert werden. Die Lösung sollte sich wesentlich aufgehellt haben und hat jetzt eine leicht orange Färbung
Das fertige Reagenz sollte in einer Braunglasflasche möglichst kühl gelagert werden. Es ist nicht unbegrenzt haltbar.


2. Färbung der Zwiebelepidermis

Eine Zwiebel ist aus mehreren übereinanderliegenden Schuppen aufgebaut. Man entnimmt der Innenseite einer Zwiebelschuppe ein Stückchen der oberflächlichen Haut. Dazu ritzt man an der Oberfläche mit einer scharfen Klinge ein kleines Quadrat und zieht mit einer Pinzette vorsichtig die Epidermis ab. Diese wird daraufhin für 10 Minuten in 96% Ethanol gelegt. Währenddessen erwärmt man in einem Wasserbad 1 M Salzsäure auf 60 °C. Auf einem Magnetheizrührer füllt man ein Becherglas mit Wasser in welches ein Thermometer ragt und erhitzt unter Rühren. In das 60°C warme Wasser taucht man ein Tablettenglas, das mit 1 M Salzsäure befüllt ist. Vorsichtig wird die Zwiebelepidermis aus dem Ethanol genommen und für 12 Minuten in der 60 °C warmen Salzsäure gelassen. Danach wird die Zwiebelepidermis entnommen und kurz in einem Uhrglas mit etwas destilliertem Wasser abgespült. Nach kurzem Waschen wird die Zwiebelepidermis in das hergestellte Feulgensche Reagenz überführt und für 1 h im Dunklen aufbewahrt. Danach ist die Färbung abgeschlossen und die Zwiebelepidermis wird zuerst erneut mit destilliertem Wasser gewaschen und danach für 5 Minuten in 96% Ethanol eingelegt. Die Zwiebelepidermis besitzt jetzt bereits einen rosaroten Farbton. Im Anschluss wird sie auf einen Objektträger überführt, 1 Tropfen Wasser aufgetropft und vorsichtig ein Deckglas aufgelegt. Jetzt kann das Präparat unter dem Mikroskop betrachtet werden.


Anmerkungen:

Das Reagenz ist, wie bereits angemerkt, nicht unbegrenzt haltbar und sollte kühl und dunkel gelagert werden. Sobald das Reagenz einen Rotstich aufweist ist es unbrauchbar.
Gewebe werden vor dem Färben sonst meist fixiert, worauf ich hier verzichtet habe, da es bei diesem simplen Präparat, nicht notwendig ist.
Auch die Einwirkzeit des Feulgen'schen Reagenzes variiert von Präparat zu Präparat, liegt jedoch normalerweise zwischen 30 Minuten und 4 Stunden.


Entsorgung:

Alle Lösungen können verdünnt und neutralisiert dem Abwasser beigegeben werden.


Erklärung:

Fuchsin ist ein Triphenylmethanfarbstoff und enthält immer auch etwas Parafuchsin. In Wasser ist der grünlich glänzende Feststoff eher schlecht löslich. Er löst sich i verdünnter Säure unter tiefrotvioletter Farbe. Zusammen mit Kaliumdisulfit bildet Fuchsin in Salzsäure, die Fuchsinschweflige Säure. Die Fuchsinschweflige Säure, die an sich farblos ist, bindet Aldehyde, wodurch die intensive Färbung rückgebildet wird. Diese Reaktion macht man sich zunutze um Zellkerne und Chromosomen intensiv anzufärben.

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In der DNA werden durch die Behandlung mit Salzsäure die N-glycosidischen Bindungen der Purinbasen zum C1-Atom der 2-Desoxyribose hydrolysiert, wodurch es zur Bildung der apurinischen Säure kommt. Nun kann die Fuchsinschweflige Säure mit der Aldehydgruppe der offenkettigen Desoxyribose reagieren, wodurch die intensive violette Farbe des Fuchsins rückgebildet wird. Dadurch kommt es selektiv zur Anfärbung der DNA/Chromosomen.



Bilder:

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Die Ausgangsmaterialien zur Herstellung des Feulgenschen Reagenz. Da ich die Lösung bereits am Vortag hergestellt habe existieren keine Bilder von der Herstellung.

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Die Lösung nach 24 Stunden vor dem Filtrieren. Sie erscheint auf dem Bild etwas dunkler als in echt.

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Die Zwiebelepidermis in der Salzsäure im Wasserbad.

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Waschen der Zwiebelepidermis nach der Hydrolyse in Salzsäure. Im Schnappdeckelglas befindet sich das filtrierte Feulgensche Reagenz.

Bild
Fertig gefärbtes Präparat. Man erkennt die Zellkerne als scharf abgegrenzte, dunkelviolette Struktur in den Zellkernen.


Quellen:

Bruno P. Kremer: Das große Kosmos Buch der Mikroskopie; Kosmos Verlag
http://flexikon.doccheck.com/de/Feulgen-F%C3%A4rbung
http://www.chemgapedia.de/vsengine/vlu/ ... vscml.html

Alf
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Beitrag von Alf »

Hier noch als kleiner Nachtrag die gefärbten Zellkerne der Wurzelspitze einer Zwiebel. Gut zu erkennen sind die unterschiedlichen Stadien der Mitose. In dieser Aufnahme sieht man ein Anaphase Stadium, wobei die Chromatide getrennt werden und zu den Zellpolen gezogen werden. Hier ist noch eine Anleitung wie man eine Wurzelspitze präpariert.

Bild

Die Qualität ist nicht die beste, da meine Kamera nicht die beste ist und ich einfach durch das Okular fotografiere..

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Cumarinderivat
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Beitrag von Cumarinderivat »

[OT]Ich sollte wohl dringend mehr schlafen, irgendwie hab ich grade "Nudelreaktion" gelesen :D [/OT]

Ein schöner Versuch! Und auch schön dokumentiert. Die Zellkernfärbung ist wirklich sehr klar zu erkennen - und die Bilder für "durchs Okular fotografiert" auch gut ;).
Noch eine kleine Korrektur hab ich aber. Zwischen Wert und Einheit gehört ein Leerzeichen!

Und ansonsten noch herzlichen willkommen hier! Zumindest ich hab noch nichts von dir hier gelesen :).
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Uranylacetat
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Beitrag von Uranylacetat »

Ein interessanter Artikel und gut dokumentiert! :wink: Das "Schiff'sche Reagenz" kenne ich bisher nur als Reagenz auf Aldehyde und finde es als Basis für diese "Färbe-Methode" mit der zugrunde liegenden Reaktion sehr interessant.
"Der einfachste Versuch, den man selbst gemacht hat, ist besser als der schönste, den man nur sieht." (Michael Faraday 1791-1867)

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Alf
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Beitrag von Alf »

Danke für die positiven Rückmeldungen! :D
Einheiten und Werte wurden getrennt.

Heliumoxid
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Beitrag von Heliumoxid »

Ein sehr interessanter Artikel.Insbesondere das Bild mit der Zellteilung finde ich schön.
Ein Literaturhinweis/Quelle sollte noch dabei sein.
Bei Heliumoxid, genauer Helium(II)- oxid, handelt es sich um eine Mischung aus Helium(I)- oxid und Helium(III)- oxid. Richtigerweise heisst es somit Helium(I,III)- oxid.

Alf
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Beitrag von Alf »

Danke. Quellen wurden noch ergänzt!

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Cumarinderivat
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Beitrag von Cumarinderivat »

Noch ein kleiner Tipp zur Quellenangabe, bei dem Buch könntest du noch Auflage und Erscheinungsjahr angeben, Internetquellen werden üblicherweise wie folgt angegeben: Titel, URL, (Autor,) Zugriffszeitpunkt (Datum)
In deinem Fall also bspw.: Feulgen-Färbung, http://flexikon.doccheck.com/de/Feulgen-F%C3%A4rbung, (DocCheck Medical Services GmbH,) 29.12.2017.
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Lithiumoxalat
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Beitrag von Lithiumoxalat »

Schöner Versuch!

Nun könnte man das gefärbte Präpparat noch in Glyceringelatine einbetten, um es für längere Zeit zu konservieren.

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lemmi
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Beitrag von lemmi »

Sehr schöner Artikel! Das wollte ich auch mal hier dokumentieren, weil es eine schöne Anwendung für das Schiff´sche Reagenz ist. Ich habe diese Reaktion im Studium im Rahmen des Biologiepraktikums auch mit Zwiebel-Wurzelspitzen durchgeführt und ein sehr schönes Präparat erhalten in dem alle Mitosestadien klar zu sehen waren (da das inzwischen 30 Jahre her ist, habe ich das Präparat nicht mehr :wink: ).

@Alf: Ich vermute dass du das auch im Rahmen des Studiums gemacht hast? Gibst du bitte auch noch die Vorschrift an, wie man die Wurzelspitze färbt!?

Noch eine Bemerkung zum Schiff`schen Reagenz. Für mikroskopische Zwecke stelle ich es genauso her wie du - aber mit weniger Salzsäure: 10 ml 1N Salzsäure, 0,5 g Fuchsin ud 0,5 g Natriumbisulfit auf 100 ml. Ausserdem gebe ich nach 24 Stunden 0,5 g Aktivkohle zu und filtriere, wodurch man ein wasserklares Reagenz erhält. Letzteres ist für deine Zwecke vermutlich unnötig - denn dein Versuch hat ja geklappt. Wenn man aber z.B. Polysaccharide anfärben will (PAS-Reaktion) dann klappt das nur mit einem weniger Salzsäure enthaltenden und ganz farblosen Reagenz. Ich schmelze es mir 5 ml-weise in Ampullen ein (ich brauche es nur selten), darin hält es sich unbegrenzt. An der Luft wird es nach einiger Zeit von selbst rot - und dann kann man es fortschütten.

Man muss nicht in Glyceringelatine einschließen. Man kann das Präparat auch in einer aufsteigenden Akoholreihe entwässern und in Eukitt einschließen.
"Alles sollte so einfach wie möglich gemacht werden. Aber nicht einfacher."(A. Einstein 1871-1955)

"Wer nur Chemie versteht, versteht auch die nicht recht!" (G.C. Lichtenberg, 1742 - 1799)

"Die gefährlichste Weltanschauung ist die Weltanschauung der Leute, die die Welt nie gesehen haben." (Alexander v. Humboldt, 1769 - 1859)

Alf
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Beitrag von Alf »

Ich bin auf diese Färbemethode im Rahmen unseres Histologie Praktikums gestoßen und fand diese Anwendung sehr interessant und musste sie ausprobieren.

Vielen dank für den Hinweis mit dem Einschmelzen das ist eine super Idee!

Zu den Wurzelspitzen wollte ich einen eigenen Artikel verfassen mit Bezug zur Mitose und zur Herstellung eines Dauerpräparates, ich hoffe dass ich im Laufe dieser Woche Zeit dafür finde!

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lemmi
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Registriert: Freitag 6. Januar 2012, 09:25

Beitrag von lemmi »

[EDIT by lemmi: korrekturgelesen und verschoben]
"Alles sollte so einfach wie möglich gemacht werden. Aber nicht einfacher."(A. Einstein 1871-1955)

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