Bei Verdacht auf einen Parasitenbefall des Magen-Darm-Traktes wird zunächst ein mikroskopisches Direktpräparat angefertigt. Bei niedrigen Konzentrationen kommen Anreicherungsmethoden zum Einsatz. Ich beschreibe im Folgenden die Formol-Ether-Methode, ein klassische und leicht durchzuführende parasitologische Untersuchungstechnik. Anlass war eine Durchfallerkrankung unserer Hauskatzen.
Material/Geräte:
Objektträger, Deckgläser, spitze Holzstäbchen, Impföse, Tropfpipetten, Reibschale, Trichter, kleines Becherglas, Verbandmull, Zentrifugengläser, Zentrifuge (elektrische oder Handzentrifuge), Mikroskop
Katzenkot
Chemikalien:
Lugol‘sche Lösung zur Mikroskopie (2 g Kaliumiodid und 1 g Iod in 300 ml Aqua dest.)
physiologische Kochsalzlösung (0.9% Natriumchlorid)
Formaldehydlösung 35 %
Diethylether
alternativ:
Ethylacetat
Sicherheitshinweise:
Beim Umgang mit Stuhl oder Tierkot sind Handschuhe zu tragen, da er humanpathogene Erreger (hier: Lamblien!) enthalten kann.
Versuchsdurchführung:
1. Direktpräparat:
Zur Anfertigung eines Direktpräparates verrührt man eine sehr kleine Menge der Kot- resp. Stuhlprobe von ca. 1-2 mg (Anfänger nehmen meistens viel zu viel Material!) auf einem Objektträger in einem Tropfen physiologischer Kochsalzlösung und einem Tropfen Lugol’scher Lösung. Klassischerweise wird dazu ein spitzes Holzstäbchen verwendet, das nach Gebrauch weggeworfen wird, oder alternativ eine kleine Impföse, die nach Gebrauch in einer Bunsenbrennerflamme ausgeglüht wird. Die Suspension wird mit einem Deckgläschen abgedeckt, unter dem sich die Flüssigkeit eben bis zum Rand ausbreiten soll, um ein Präparat mit möglichst geringer Schichtdicke zu erhalten. Wenn Flüssigkeit über den Rand des Deckgläschens quillt ist das Präparat erneut, mit weniger Kochsalzlösung, anzufertigen.Das Präparat wird dann zunächst bei geringer Vergrößerung (Objektiv 10 x- Gesamtvergrößerung 100 x) mikroskopiert. Dabei muss der Kondensor stark abgesenkt werden, damit ein kontrastreiches Bild resultiert. Wenn man scharf eingestellt hat mustert man das gesamte Präparat systematisch von der linken oberen bis zur rechten unteren Ecke mäanderförmig durch. Interessierende Stellen werden zur genaueren Betrachtung mit dem 40er-Objektiv (Gesamtvergrößerung 400 x) betrachtet. Dabei ist der Kondensor etwas anzuheben, weil das mikroskopische Bild sonst nicht ausreichend ausgeleuchtet wird.
In der Kochsalzlösung lassen sich Wurmeier (Spulwurm Ascaris lumbricoides, Peitschenwurm Trichuris trichiura, Zwergbandwurm Hymenolepis nana resp. diminuta, Hakenwurm Necator americanus oder Acylostoma duodenale um die häufigsten zu nennen) oder Larven (z.B. Strongyloides stercoralis oder Hakenwurmlarven) einfach bereits bei geringer Vergrößerung erkennen, da diese Objekte mit 50-120 µm relativ groß sind. Die Trophzoiten und Zysten der Protozoen (z.B. Entamoeba histolytica, oder die hier gefundene Giardia intestinalis) sind mit 8-12 µm viel kleiner und besser mit dem 40er-Obektiv zu identifizieren, wenngleich auch sie dem Untersucher mit etwas Übung bereits in der Übersichtsvergrößerung auffallen.
Im mit Iod gefärbten Präparat (in der Lugol’schen Lösung) lassen sich die Protozoen besser erkennen, da die subzellulären Strukturen – insbesondere die Zellkerne – deutlich angefärbt werden. Giardia intestinalis bildet ovale, 8-12µm lange und ca. 6 µm breite Zysten aus, die eine S-förmige Geißelanlage sowie vier Zellkerne enthalten, von denen meist immer nur einer oder zwei in einer Schärfenebene sichtbar sind.
2. Formol-Ether-Anreicherung:
Man verdünnt die übliche 35 %ige Formalinlösung im Verhältnis 1+9 mit physiologischer Kochsalzlösung (1 ml Formaldehydlösung und 9 ml Kochsalzlösung). In einer Reibschale verreibt man eine etwa bohnengroße Probe des Untersuchungsmaterials mit 10 ml der Formol-Kochsalz-Lösung und gießt die Mischung durch einen kleinen Trichter, den man mit einer Lage Verbandmull ausgelegt hat, in ein kleines Becherglas. Das trübe Filtrat schüttelt man in einem Zentrifugenröhrchen mit 3-4 ml Ether gut durch und zentrifugiert anschließend bei etwa 3000 UpM für 3-4 Minuten in der elektrischen Zentrifuge oder für 5 Minuten in einer Handzentrifuge. Nach der Zentrifugation erkennt man im Röhrchen vier Schichten:
Oben befindet sich der Ether. An der Grenze zwischen Ether und wässriger Phase sind lipophile organische Stuhlbestandteile angereichert. Darunter findet sich die wässrige Phase (Formol-Kochsalzlösung) und schließlich ein meist recht geringer Bodensatz, der die interessierenden Wurmeier und Parasiten (-zysten) enthält. Man rührt den oberen Anteil vorsichtig mit einem Glasstab um, um die Grenzschicht Ether/wässrige Phase von der Wandung zu lösen, und gießt dann die oberen drei Schichten vollständig, aber vorsichtig (um das Sediment nicht mitzureißen) ab. Das Sediment wird schließlich in dem letzten verbleibenden Tröpfchen Formol-Kochsalz durch Klopfen gegen den Boden des Röhrchens resuspendiert. Mit einer Impföse oder einer Pipette entnimmt man ein Tröpfchen der Suspension und vermischt auf dem Objektträger mit etwas Kochsalzlösung bzw. Lugol´scher Lösung, legt ein Deckglas auf und mikroskopiert wie oben beschrieben. In diesem Präparat sind die Parasiten und Wurmeier konzentriert und die übrigen, die Beurteilung erschwerenden, Stuhlbestandteile weitgehend abgetrennt, so daß die Erkennung erleichtert wird.
Entsorgung:
Die gebrauchten Objektträger und die überschüssigen Proben werden in geeigneten geschlossenen Behältern für biologisches Material mit dem Hausmüll entsorgt.
Die mit den Proben kontaminierten Glasgeräte werden über Nacht in verdünnte (0,5 %ige) Natriumhypochloritlösung gelegt und dann wie üblich gereinigt.
Erklärungen:
Die Interpretation von Stuhlpräparaten ist für den Anfänger schwierig, weil die Proben eine Vielzahl morphologischer Bestandteile enthalten, die im Einzelfall von den interessierenden Strukturen - Wurmeiern und Parasiten bzw. deren Zysten – unterschieden werden müssen. Es können Stärkekörner, unverdaute Muskelfasern, Pflanzenfasern, Gewebefetzen tierischer und pflanzlicher Nahrung, Fetttröpfchen oder Klümpchen von Fettsäuren, mineralische Bestandteile wie Oxalatkristalle neben den zahlreichen intestinalen Bakterien und ggf. apathogenen Einzellern (z.B. Hefen) unterschieden werden. Die Anreicherungsmethode nutzt die unterschiedliche Größe und Dichte der verschiedenen Stuhlbestandteile aus. Nachdem grobe Bestandteile (über 200 µm) mittels Filtration durch grobmaschigen Mull entfernt wurden, werden die spezifisch leichteren und lipophilen Bestandteile durch Ausschütteln mit Ether und anschließendes Zentrifugieren von den spezifisch schwereren Parasiten und Wurmeiern getrennt. Der Formolzusatz macht die Verarbeitung hygienischer und gibt die Möglichkeit, die Probe vor der Auswertung eine Weile aufzubewahren ohne dass sie sich – vor allem in warmem Klima - verändert. Anstelle von Ether kann genauso gut Ethylacetat verwendet werden.
Giardia intestinalis (früher Giardia lamblia) ist ein parasitäres Protozoon, das den oberen Dünndarm von bestimmten Säugetieren – darunter der Mensch, der Hund und die Katze – besiedelt. Lamblien wurden bereits von Leuvenhoek, dem Erfinder des Mikroskopes, 1681 (im eigenen Stuhl) beobachtet, und nach erneuten Beschreibungen durch den französischen Biologen Alfred Mathieu Giard (1846 – 1908) und den böhmischen Kinderarzt Vilém Dusan Lambl (1824 – 1895) von dem amerikanischen Zoologen Charles W. Stiles (1867-1941) als Giardia lamblia benannt.
(Abbildung aus: Practical Laboratory Manual for Health Centers in Eastern Africa -, s. Literatur)
Der Lebenszyklus der Lamblien umfasst eine vegetative Form, den Trophozoiten, der aktiv mit Geißeln beweglich ist und sich durch Zweiteilung vermehrt, und eine Dauerform, die Zyste. Die Trophozoiten besiedeln den Darm - und zwar den Zwölffingerdarm und das obere Jejunum - und ernähren sich vom Darminhalt, dringen aber nicht in die Darmwand ein (weshalb Lamblienbefall in der Regel kaum Bauchschmerzen und keine blutigen Stühle bewirkt). Wenn sie sich stark vermehren, behindern die Parasiten die Aufnahme der Nährstoffe durch die Darmwand, was zu Malabsorption und Durchfällen führt. In dieser Situation können mobile Trophozoiten im Kot nachgewiesen werden. Das entsprechende Krankheitsbild wird Lambliasis oder Giardiasis genannt. In der Regel ist der Befall aber nur mäßig, die Symptome sind nur leicht oder fehlen ganz, und in den Darmausscheidungen finden sich ausschließlich die Zysten, welche so per vias naturales in die Außenwelt gelangen, wo sie bis zu 4 Monaten lebensfähig bleiben und erneut von einem Wirt aufgenommen werden können. Infektionen mit Lamblien beim Menschen sind in warmen Ländern sehr verbreitet (rund 10% der Weltbevölkerung sollen infiziert sein!) und werden verständlicherweise durch schlechte hygienische Bedingungen (Fehlen einer suffizienten Kanalisation, Zusammenleben auf engem Raum) begünstigt. Auch in Deutschland kommen sie autochthon vor, wenngleich viel seltener als in den Tropen. Bei Katzen sind Lamblien ebenfalls häufige Durchfallerreger, wobei mir nicht bekannt wäre, daß Kontakt zu Katzen ein Risikofaktor für eine Infektion beim Menschen darstellte (wie das z.B. bei der Toxoplasmose durchaus der Fall ist). Wahrscheinlich liegt das daran, daß für Menschen andere Genotypen pathogen sind, als für die Tiere.
Wie oben gezeigt, ist der Nachweis von Lamblien im Stuhl mit einfachen mikroskopischen Techniken möglich. Bei sehr geringem Befall kann ein Antigennachweis mittels ELISA (enzyme-linked immuno-sorbent assay) weiterhelfen. Die - ästhetisch durchaus ansprechende – Feinmorphologie des Parasiten, insbesondere der vegetativen Formen, kann durch eine Färbung mit Eisenhämatoxylin oder Giemsa-Lösung sichtbar gemacht werden.
(Abbildung aus: Atlas de Parasitología – s. Literatur)
Für die Routinediagnostik ist das aber zu aufwändig und auch gar nicht nötig.
Die Therapie der Lambliasis erfolgt mit dem Imidazolderivat Metronidazol (2-(2-Methyl-5-Nitro-Imidazol-1-yl)-ethanol).
Katzen wird eine Dosis von 15-25 mg / kg Körpergewicht zweimal täglich über 5 Tage verabreicht. In seltenen Fällen bestehen Resistenzen, und es muß auf andere Wirkstoffe ausgewichen werden. Während der Kur muss die Katzentoilette gut gereinigt werden, um eine Reinfektion durch lebende Zysten im bereits abgesetzten Kot zu verhindern. In der Humanmedizin werden 1000-1200 mg Metronidazol pro Tag in 2-3 Einzeldosen für 5-7 Tage gegeben.
Literatur:
1. Myriam Lopez Paéz , Augusto Corredor Ajona und Ruben Nicholls Orejuela : Atlas de Parasitología ; Editorial Manual Moderno, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá 2006; ISBN 978-958-9446-17-1
2. Monica Cheeseborough: District Laboratory Practice in Tropical Countries, Part I; Tropical Health Technology, Doddington/March, Cambridgeshire 1998; ISBN 0-9507434-4-5
3. Jane Y Carter und Orgenes E.Lema: Practical Laboratory Manual for Health Centers in Eastern Africa; Gesundheitshilfe Dritte Welt / German Pharma Health Fund e.V. Frankfurt am Main (ohne Jahreszahl, ca. 1994)
Bilder:
Herstellung eines Direktpräparates. Die Kotprobe befindet sich in dem Spatelröhrchen links.
Herstellung einer Kotsuspension in Formol-Kochsalzlösung und Filtration durch Mull.
Die filtrierte Suspension nach dem Schütteln mit Ether und Zentrifugation.
Effekt der Anreicherung: Zysten von Giardia intestinalis gefärbt mit Lugol´scher Lösung bei 100-facher Vergrößerung. Oben: Direktpräparat mit 2 Zysten. Unten: Präparat aus dem Sediment der Formol-Ether-Anreicherung (11 Zysten im Bildausschnitt)
Zysten von Giardia intestinalis im Nativpräparat nach Anreicherung, ebenfalls bei 100-facher Vergrößerung.
Zysten von Giardia intestinalis bei 400-facher Vergrößerung, oben nativ, unten mit Lugol’scher Lösung gefärbt. Beachte die S-förmige Linie (das Axosom, aus dem die Geisseln entspringen), die der Zyste etwas das Aussehen einer Kaffeebohne verleiht, sowie die Darstellung der Zellkerne (die beiden kleinen hellen Punkte am unteren Pol der mit Iod gefärbten Zyste). Bei genauem Durchfokussieren findet man in jeder Zyste 2 oder 4 Kerne.
