Auf diesem Verfahren basieren Reagenzien für die Nukleinsäurenextraktion wie z.B. TRIzol Reagent® der Firma Invitrogen (Life Technologies™) oder TriFast™ der Firma peqLab. Heutzutage werden vermehrt DNA-/ RNA-Isolationskits verwendet. Diese basieren auf einem anderen System.
Geräte:
Zentrifuge, Vortexer oder Radschüttler (je nach gewünschter Größe der Nukleinsäuremoleküle), PCR Reaktionsgefäße, Mikroliterpipetten (100 - 1000 µL, beim späteren Trennen der Phasen bietet sich auch eine Pipette von 2 – 20 µL an), Pipettenspitzen in Racks
Chemikalien:
Probe (aus Escherichia coli)
(von der isolierten Nukleinsäure geht keine biologische Gefahr mehr aus)Phenol
Tris- bzw. TE- gepuffert (*) Chloroform
3-Methyl-1-butanol
2- Propanol
oder
Ethanol
(*) Der TE-Puffer inhibiert keine an der PCR beteiligten Enzyme wie z.B. Polymerasen, inhibiert aber Nukleasen und eignet sich daher besonders gut zur Pufferung von Lösungen die Nukleinsäuren enthalten und für die PCR/ Sequenzierung erstellt wurden. Der TE-Puffer besteht aus TRIS (Tris(hydroxymethyl)-aminomethan) und EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure), oft auch das Natriumsalz EDTA-Na (Dinatrium-ethylendiamin-tetraacetat). In der Molekularbiologie ist der TE-Puffer Standard um den Abbau von DNA und RNA zu verhindern. Er sollte nicht mit dem für die Agarosegelelektrophorese erforderlichen TBE-Puffer (Tris-Borat-EDTA) verwechselt werden.
Anleitung für einen 1X TE-Puffer:
10 mM (1.21 g/L) TRIS
1 mM (0,372 g/L) EDTA
Der pH-Wert wird mit Natronlauge und Salzsäure auf 8,0 eingestellt (bzw. auf den angegebenden Wert).
Hinweis:
Phenol ist giftig. Chloroform steht im Verdacht Krebs zu erzeugen! Versuche sollten unter dem Abzug durchgeführt werden. Für den Versuch sollte nur Phenol genommen werden, welches keine Oxidation aufweist. Alle Arbeitsgeräte und Einmalartikel sollten steril, Ribonuklease und Desoxyribonuklease frei sein (z.B. Eppendorf Biopur). Bei Bedarf kann man aber entsprechende Enzyme hinzugeben um entweder DNA oder RNA zu erhalten.
Durchführung:
Zunächst wird eine 1:1 Mischung aus Phenol und Chloroform erstellt. Dabei sollte sich alles Phenol in dem Chloroform lösen. Etwas 3-Methyl-1-butanol (Isoamylalkohol) kann obligatorisch hinzubegeben werden.
Man gibt die Nukleinsäure haltige Probe in ein PCR Reaktionsgefäß und gibt 1 Volumen (z.B. 500 μL) der zuvor erstellten Mischung hinzu. Zur Isolation von kleinen DNA/ RNA Molekülen (<100 kb) wird die Probe gevortext, mittlere DNA Moleküle (10-30 kb) durch leichtes Schütteln oder durch schnelles Kippen, große DNA Moleküle (>30 kb) z.B. durch Drehen auf einem Radschüttler. Die Probe wird nun eine Minute bei 80% zentrifugiert, sollte danach keine klare Trennung der Phasen zu erkennen sein, kann weiter bis 10 min. lang zentrifugiert werden. An der Grenzlinie zwischen den Phasen müsste nun eine denaturierte weiße Ansammlung von Proteinen zu sehen sein. Die wässrige Phase (meistens oben) kann nun mit einer Pipette abpipettiert werden und in ein neues PCR Reaktionsgefäß gegeben werden. Die mittlere und untere Phase kann verworfen werden. Die bisher genannten Schritte werden solange wiederholt, bis keine Proteine mehr zu erkennen sind. Zur Reinigung der Nukleinsäure von Phenol wird 1 Volumen Chloroform hinzu gegeben und die Schritte wiederholt. (Sollte nur Phenol verwendet worden sein, sollte dieser Schritt zweimal erfolgen!)
Rückgewinnung der Nukleinsäure durch Präzipitation mit 2 Volumina 2- Propanol, alternativ Ethanol.
Entsorgung:
Der überstand wird zu den halogenhaltigen organischen Abfällen gegeben. Die gereinigte Nukleinsäure kann für weiter molekularbiologische Zwecke (z.B PCR oder Sequenzierung) verwendet werden.
Erklärung:
Da für Molekularbiologische, Biochemische und Gentechnische Verfahren möglichst reine Nukleinsäuren benötigt werden, müssen diese von den Proteinen aus der lysierten Zelle deaktiviert und getrennt werden. Einer der wichtigsten Verfahren zur Trennung von Proteinen und Nukleinsäuren ist diese Extraktion. Die Proteine werden durch das Phenol denaturiert. Die DNA bzw. auch RNA sammelt sich in der wässrigen Phase an und kann leicht von der Zwischenphase getrennt werden.
Die Phenol Extraktion ist hocheffizient, da schon nach 3 Phenol Extraktionen sehr reine Nukleinsäure-Fraktionen erhalten werden können. Das Phenol sollte für eine DNA Extraktion Tris- bzw. TE- gepuffert sein und ein pH-Wert von 7,8 haben. Für die RNA Aufreinigung wird in Aqua. Dest. gelöstes Phenol verwendet, dass einen pH-Wert von 4,8 besitzt. Bei diesem pH-Wert wird die DNA gezwungen, sich in der organischen und der Protein- Interphase anzureichern, dies verringert eine Kontamination der RNA durch DNA. Meistens befindet sich die wässrige Phase oben, allerdings können sich auch beide Phasen mischen, sogar invertieren (Wenn große Mengen gelöste Stoffe enthalten sind z.B. Salze oder Zucker. Das Invertieren kann durch eine 1:1 Mischung aus Phenol und Chloroform verhindert werden, da aufgrund der höheren Dichte des Chloroforms eine klare Unterscheidung beider Phasen möglich ist. Isoamylalkohol kann hinzugegeben werden um das Schäumen der Organischen Phase zu verhindern, welches das pipettieren stark behindern kann.
Dieses Verfahren, auch „single step“ genannt, war das Erste mit dem DNA und RNA getrennt werden konnten. Es wurde von Piotr Chomczynski und Nicoletta Sacchi entwickelt.
Oft enthält das Phenol/ Chloroform Gemisch ein Denaturierungsagent wie Guanidiniumthiocyanat. Das Guanidiniumthiocyanat kann Zellen lysieren und RNasen sowie andere Enzyme inaktivieren.
Bilder:
Zugabe von Phenol/ Chloroform zur Probe.
Vortexen zum gewinnen von kleinen DNA/ RNA Molekülen.
Zentrifugieren zum trennen der Phasen.
Die weiße Phase enthält die denaturierten Proteine.
Zugabe von Chloroform um die Nukleinsäure von Phenol zu reinigen.
Rückgewinnung der Nukleinsäure.
