Botanische Mikrotechnik und Pflanzenpathogene

Interessante Versuche aus der Biologie, Biochemie und Biotechnologie.

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Alf
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Botanische Mikrotechnik und Pflanzenpathogene

Beitrag von Alf »

In diesem Artikel aus dem Bereich der Biologie möchte ich auf die Herstellung botanischer Paraffinschnitte eingehen und die Unterschiede zu tierischem Gewebe erklären. Danach möchte ich ein paar Präparate aus dem Gebiet Pflanzenerkrankungen vorstellen, da ich diese besonders interessant finde. Dafür ich einerseits prototypisch auf die normale Struktur eines Laubblattes eingehen, andererseits verschiedene Pathogene und die Veränderungen, die sie an Blättern verursachen in mikroskopischen Präparaten zeigen.
Da ich in einem anderen Artikel schon die Herstellung von Paraffinschnitten beschrieben habe, werde ich hier nur mehr auf die Unterschiede, die sich bei der Verwendung von pflanzlichen Objekten ergeben, eingehen.
Auch bei den durchgeführten Färbungen verweise ich auf folgende Seite (Aeisner), die eine umfassenden Überblick über verschiedenste Farbstoffe und histologische Färbungen bietet. Die Färbungen werden hier Schritt für Schritt erklärt. Ich werde nur meine persönliche Erfahrung und eventuelle Modifikationen erklären.

Material/Gerätschaften:
Mikroskop, Mikrotom, Wärmeschrank, Pinzetten, Objektträger, Deckgläser


Chemikalien:

Ethanol 96 % Warnhinweis: f

Isopropanol Warnhinweis: f

n-Butanol Warnhinweis: cWarnhinweis: f

Xylol/Toluol Warnhinweis: attnWarnhinweis: xnWarnhinweis: f

Formaldehyd 20 % Warnhinweis: attnWarnhinweis: xn

Essigsäure 80 % Warnhinweis: cWarnhinweis: f

Astrablau

Fuchsin Warnhinweis: attnWarnhinweis: xn

Säurefuchsin Warnhinweis: attn

Chrysoidin Warnhinweis: attnWarnhinweis: xnWarnhinweis: n

Auramin O Warnhinweis: attnWarnhinweis: xnWarnhinweis: n

Malachitgrün (Chlorid- oder Oxalatsalz) Warnhinweis: attnWarnhinweis: xnWarnhinweis: cWarnhinweis: n

Martiusgelb (2,4-Dinitro-1-naphthol) Warnhinweis: attn


Warnhinweis:
Beim Arbeiten mit Formaldehyd, Toluol und Xylol auf ausreichende Lüftung achten. Formalin, Fuchsin, Auramin O, Chrysoidin und Malachitgrün sind CMR-Stoffe. Beim Herstellen der Lösungen Handschuhe tragen, da auch kaum sichtbare Mengen ganze Kleidungsstücke und Möbel dauerhaft anfärben.
Mit Mikrotomklingen und -messern sehr umsichtig arbeiten, sonst drohen schwere Schnittverletzungen!


Benötigte Lösungen/Färbevorschriften/Eigenschaften:
Zuerst wurden die notwendigen Lösungen hergestellt. Dabei kann man sich an die bei Aeisner unter Methoden beschriebenen Rezepte halten. Teilweise wurde Rezepturen modifiziert.

a) AFE:
Im Gegensatz zur tierischen Histologie, in der 4 % Formalin das universelle Fixiermittel ist, ist bei botanischen Präparaten AFE (Alkohol-Formalin-Essigsäure) das Standardfixiermittel. Da ich weder Eisessig, noch 40 % Formalin besitze habe ich die bei Aeisner beschriebene Rezeptur angepasst. Es besteht aus:
  • 69 ml Aqua dest.
  • 15 ml Ethanol 96 %
  • 10 ml Formalin 20 %
  • 6 ml Essigsäure 80 %
b) Pianese-Färbung:
findet man unter Methoden. Die Farbstofflösungen werden wie beschrieben gemischt und die Färbung wie angegeben durchgeführt, außer dass nach dem Differenzieren gleich mit Isopropanol abgespült wurde, wodurch die Differenzierung sofort gestoppt wird. Beim Differenzierungsschritt muss man etwas experimentieren für ein möglichst optimales Ergebnis. Beim Mischen der Säurefuchsin und Malachitgrün Lösung fällt ein dicker Niederschlag aus, der sich später bei der Zugabe von Ethanol teilweise wieder löst. Die fertige dunkelblaue Lösung wurde über Nacht stehen gelassen und dekantiert. Sie konnte trotz kleiner Partikel problemlos verwendet werden. Die Rolle von Martiusgelb ist mir etwas unklar und ich vermute, dass die Färbung auch ohne Martiusgelb funktioniert.
Die Pianese-Färbung ist eine selten benutzte Färbung, zu der man relativ wenige Informationen findet. Sie dient primär der Färbung von pilzinfizierten Pflanzen. Hyphen der Pilze färben sich rot-violett an während sich die pflanzlichen Zellen grün anfärben (je nach Pflanze auch etwas rot), abhängig vom Verholzungsgrad. Dadurch lassen sich die invasiv wachsenden Hyphen der Pilze gut nachverfolgen. Je stärker die Zelle verholzt, desto grüner färbt sie sich an. Zellkerne und Chloroplasten färben sich auch weitgehend grün. Während der Differenzierung wird fast nur die grün färbende Komponente herausgelöst. Da Blätter kaum lignifizierte, also verholzte, Zellen beinhalten, bleiben sie Großteils ungefärbt. Weist das Blatt jedoch eine Defektstelle, mechanisch, oder infektiös auf, beginnt ein schützender Verholzungsprozess. Deshalb ist diese Färbung sehr schön geeignet Defektstellen jeder Art kontrastreich darzustellen.

c) Fuchsin-Chrysoidin-Astrablau-Auramin O:
ist eine etwas abgewandelte Form der Fuchsin-Chrysoidin-Astrablau Färbung n. Etzold.
  • I) 0,5 g Fuchsin in 50 ml Ethanol 96 %
  • II) 0,5 g Astrablau, 0,5 g Auramin O, 0,1 g Chrysoidin in 50 ml warmen Aqua dest.
Lösung a) und b) mischen, erwärmen, abkühlen lassen und filtrieren.
Gefärbt wurde, indem die Schnitte für 15 Minuten in die Lösung eingestellt wurden und danach direkt mit Isopropanol abgespült wurde. Danach wurde sofort entwässert, wodurch eine schöne Differenzierung erreicht wird. Im Originalrezept wird mehr differenziert, bei sehr dünnen Mikrotomschnitten würde dadurch aber zu viel Farbstoff ausgezogen werden.
In dieser Färbung stellen sich verholzte Zellwände je nach Verholzungsgrad gelb-orange-rot und unverholzte Cellulosezellwände blau dar. Diese Färbung ist eine Standardmethode in der Botanik.


Schnittherstellung:
die verwendeten Pflanzenstücke wurden sofort nach dem Entnehmen für 48 Stunden in AFE fixiert. Im Gegensatz zu tierischem Gewebe, enthalten Pflanzenzellen sehr viel Luft. Deshalb wurden die Objekte nach dem Fixieren in einen Rundkolben mit 50 % Ethanol überführt. Danach wurde mittels einer Wasserstrahlpumpe für 10 Minuten ein Vakuum angelegt, wodurch die gesamte Luft aus den Objekten entfernt wurde. Dieser Schritt ist absolut essenziell, da die Luftblasen ein späteres Schneiden unmöglich machen würden. Die restliche Entwässerung und Einbettung verläuft genau wie bei der tierischen Histologie.
Das Schneiden von pflanzlichen Objekten ist teilweise schwieriger, da sie wesentlich härter sind als tierische Objekte. Stark verholzte Proben können an einem Rotationsmikrotom nur schwer geschnitten werden und liefern meist wenig zufriedenstellende Ergebnisse. Für das Schneiden stark verholzter Objekte ist ein Schlittenmikrotom erforderlich. Blätter, Wurzeln, Stängel, Knospen, Blüten und wenig verholzte Triebe stellen aber für das Rotationsmikrotom Im Regelfall kein Problem dar. Das Strecken, Aufziehen, Entwässern, Färben und Eindecken mit Malinol läuft genauso ab wie für die tierische Histologie beschrieben.
Die Objektträger müssen wirklich sauber sein, man kann sie reinigen indem man eine Seite gleichmäßig in die rauschende Bunsenbrenner Flamme hält und langsam Abkühlt. Durch diese Behandlung haften die erstellten Schnitte und diffundieren kaum ab. Man kann dann sogar auf Glycerin-Eiweiß oft verzichten. Dieser Prozess erfordert etwas Übung und anfangs zerspringen die Objektträger manchmal durch zu starkes Glühen, ungleichmäßiges Erwärmen, oder zu rasche Abkühlung. Man erhält aber sehr saubere Objektträger und erspart sich das Arbeiten mit aggressiven Gemischen (Chromschwefelsäure, Carosche Säure).
Die gewählte Schnittdicke beträgt 5 - 10 Mikrometer für infizierte Pflanzen, Präparate in denen man Zellkerne darstellen möchte, Blüten und Knospen. Zur Betrachtung der allgemeinen Histologie sind Schnittdicken bis zu 70 Mikrometer (Handschnitte) sehr brauchbar, da auch die dreidimensionale Struktur eine Rolle spielt.

Handschnitte:
Im Hobbybereich ist das Herstellen von botanischen Paraffinschnitten nicht sehr verbreitet. Mit etwas Übung kann man sehr schöne Freihandschnitte mit Rasierklingen erstellen. Für anatomische Betrachtungen sind Handschnitte den Paraffinschnitten nicht unbedingt unterlegen. Die Schneidbarkeit eines Objektes hängt dabei vor allem von der Stabilität ab. Man kann relativ einfach sehr gute Schnitte von Stängeln, etc. anfertigen. Das Schneiden von Blättern, unzusammenhängenden Strukturen und generell weichen Objekten mit der Hand ist jedoch schwieriger. Abhilfe schafft dafür das Umschließen des Blattes mit einer Möhre, oder Holundermark.

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Abb. 1: fertige Präparate


Blattanatomie:

Am Blatt eines Oleanders (Abb. 2) kann man den prototypischen Aufbau von Laubblättern sehr gut nachvollziehen. Eine Besonderheit des Oleanders sind die Stomagruben die mit Trichomen (Haaren) ausgekleidet sind. In diesen Einsenkungen findet man die Spaltöffnungen, wodurch ein Verdunstungsschutz gewährleistet werden kann.
Die obere Epidermis (oEP) ist noch von einer ungefärbten Cuticula überzogen. Beim Oleander ist die obere Epidermis mehrreihig.
Darunter liegt ein zweireihiges Palisadenparenchym (Pp), deren Zellen zylindrisch geformt und dicht gedrängt sind. Sie beinhalten viele Chloroplasten und sind der Hauptort der Photosynthese.
Im Schwammparenchym (Sp) stehen die eher kugeligen, divers geformten Zellen weniger dicht. Zwischen den Zellen liegen zahlreiche Interzellularräume. Das Schwammparenchym dient vor allem dem Gasaustausch.
Im Schwammparenchym liegen Leitbündel (Lb), die makroskopisch als Blattadern imponieren. Darin werden Wasser in die Blätter und Nährstoffe zu den Wurzeln transportiert.
In der mehrschichtigen unteren Epidermis (uEp) ist die Mehrzahl der Spaltöffnungen (Stomata) eingebettet. Beim Oleander, wie auch bei anderen Pflanzen trockener Standorte haben Pflanzen Wege entwickelt eine übermäßige Verdunstung zu verhindern. In diesem Fall liegen die Stomata in einer Stomatagrube (StGr), die mit Trichomen übersät ist. Die eigentlichen Stomata erkennt man in Abb. 3 rot gefärbt in den Stomatagruben.

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Abb. 2: Hämatoxylin-Eosin Färbung; Oleander, Blatt

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Abb. 3: FAC n. Etzold; Stomatagrube mit Stomata in rot


Gallapfel:
Galläpfel werden durch die sehr verbreitete, sich entwickelnde Larve der Gallwespen hervorgerufen (Abb.5 und 6). Die befruchteten Eier legt die Gallwespe in die noch ungeöffneten Knospen der Eiche. Die Larve sezerniert Wachstumsfaktoren wodurch es am infizierten Blatt zur Ausbildung einer harten, kugeligen Struktur, in deren Inneren die Larve heranwächst, ehe sie im Juni schlüpfen.
Diese Galläpfel wurden Ende April entnommen, die Larve war hier noch in einem Entwicklungsstadium, so finden sich zahlreiche Mitosefiguren. o finden sich zahlreiche Mitosefiguren.
Galläpfel lagern Tannine ein und wurden früher zur Herstellung der Eisengallustinte benutzt. Der Versuch die Tannine mit Eisen(II)sulfat nachzuweisen ergab keine Färbung. Eventuell setzt die Bildung der Tannine in einem späteren Stadium ein, oder sie wurden beim Einbetten herausgelöst.
Abb. 6 zeigt einen Querschnitt durch den Gallapfel. In der Mitte rot sieht man die Larve (L) und herum einen roten Kokon (K). Der Kokon enthält zahlreiche Stärkegranula und dient der Ernährung der Larve.

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Abb. 4; Frühe Galläpfel an Blattunterseite; nach AFE Fixierung

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Abb. 5; Makroskopischer Anschnitt der Galläpfel; zentral der weiße „Kokon“

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Abb. 6; FAC-Auramin O; Gallapfel


Rostpilze:
Sind eine Gruppe weit verbreiteter Pathogene, die unterschiedliche Pflanzen befallen. Sie haben einen relativ komplizierten Lebenszyklus. Manche, wie der Getreideschwarzrost (Puccinia graminis , Abb. 8) sind von wirtschaftlicher Bedeutung. Makroskopisch sieht man rostbraune, streifige Veränderungen (Abb. 7), vor allem im Spätherbst. Im mikroskopischen Präparat erkennt man auf dem gesunden Weizenblatt, das rosa Pilzmycel aus dem die Aecidien hervorwachsen, deren Form man modern als „cake pop“ Form beschreiben könnte. Links davon ein befindet sich ein Leitbündel. In der Pianese-Färbung kann man die schlauchartigen Hyphen sehr gut erkennen.

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Abb. 7; fixiertes Blatt mit streifigen, bräunlichen Auflagerungen parallel zu den Blattadern

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Abb. 8; Pianese-Färbung; Getreideschwarzrost

Ein weiterer Vertreter der Rostpilze ist der Brombeerrost Getreideschwarzrost ( Phragmidium violaceum ). Er ist sehr verbreitet und äußert sich primär durch eine Rostbraune Verfärbung auf der Blattoberfläche. Im Herbst bilden sich die Überwinterungsformen der Sporen, die Teuleutosporen. Sie erscheinen als Anhäufung schwarzer Punkte an der Blattunterseite (aab. 9). Abb. 10 ist eine Übersichtsaufnahme und man sieht den Pilz mit den Teleutosporen aus dem Blatt herauswachsen. In Abb. 11 kann man die rosa Hyphen sehen, die das gesamte Blatt durchsetzen. Sie breiten sich hauptsächlich interzellulär, also zwischen den Zellen aus. Dabei beginnen einige Zellen zu verholzen und färben sich tiefgrün. Das gesunde Blatt am rechten Bildrand ist praktisch ungefärbt und frei von Hyphen.

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Abb. 9; natives Blatt mit schwarzen punktförmigen Anhäufungen an der Blattunterseite

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Abb. 10; Pianese-Färbung; Brombeerrost

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Abb. 11; Pianese-Färbung; Brombeerrost

Als letzten Vertreter der Rostpilze stelle ich den Birnengitterrost (Gymnosporangium sabinae) vor. Auch diese Infektion beginnt im Sommer mit einer rostfarbenen flachen Veränderung an den Blättern. Im Herbst bilden sich an der Blattunterseite Wucherungen aus (Abb. 12), in denen die Aecidiosporen heranreifen. Abb. 13 zeigt eine Übersicht der Wucherung in der sich 2 ovale Aecidien befinden, in denen die Aecidiosporen reifen. Die gesamte Wucherung ist von Hyphen durchsetzt, man erkennt sie in Abb. 14 neben dem Mycel der Aecidien. Die Ausbreitung erfolgt interzellulär. In der gesamten Wucherung finden Verholzungen von Zellen statt. An der Blattoberseite bilden sich andere Strukturen, die Pyknidien (Abb. 15).

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Abb. 12; fixiertes Blatt makroskopisch mit typischer Wucherung an der Blattunterseite; die schwarzen Punkte sind die Austrittstellen der Aecidiosporen

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Abb. 13; Pianese-Färbung; Übersichtsaufnahme

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Abb. 14; Pianese-Färbung

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Abb. 15; FAC-Auramin O


Rebenpockenmilbe:
Bei Befall mit der Rebenpockenmilbe bilden die Blätter ebenfalls Pflanzengallen, die an der Oberfläche makroskopisch als warzenförmige Wucherung imponieren. Das Blatt bildet als Reaktion an der Unterseite außerdem einen dicken Haarfilz (Abb. 16). In den Abbildungen 17 (FAC-Auramin O), 18 (FAC-Auramin O mit Lugolscher Lösung), und 19 (Pianese-Färbung) sieht man die Larvenkammer in unterschiedlichen Färbungen. In Abb. 18 wurde nach der FAC-Auramin O Färbung noch kurz mit Lugolscher Lösung gefärbt, wodurch man die Stärkeeinlagerung als braune Granula gut erkennen kann. Mit der Pianese-Färbung wurde eine Co-Infektion mit Pilzen ausgeschlossen, die manchmal auftritt. In der Kammer in Abb. 19 (am unteren Bildrand) ist die Larve gut abgebildet (braune Elemente, wahrscheinlich der Kopf). In Abb. 20 sieht man einen gesunden Teil des Blattes FAC-Auramin O gefärbt, es kontrastiert die eindrucksvolle Veränderung, die durch den Milbenbefall induziert wird. Zufällig wurde in der Pianese-Färbung ein kleines pilzinfiziertes Areal entdeckt (Abb. 21). Wieder zeigt sich eine Verholzung und oberflächlich rosa gelegene Pilzhyphen. Das einfache Auffinden dieser Defektstellen demonstriert die hervorragende Anwendbarkeit der Pianese-Färbung.

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Abb. 16; Makroskopische Aufnahme (schon fixiert); zahlreiche warzenförmige Auswüchse

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Abb. 17; FAC-Auramin O; Rebenpockenmilbe Kammer

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Abb. 18; FAC-Auramin O und Lugolscher Lösung; Rebenpockenmilbe Kammer

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Abb. 19; Pianese-Färbung; Rebenpockenmilbe Kammer

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Abb. 20; FAC-Auramin O; gesundes Blatt Weinrebe; normales Laubblatt mit vielen roten Chloroplasten

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Abb. 21; Pianese-Färbung; Pilzinfektion


Entsorgung:
alle Lösungsmittel sind im Lösungsmittel Abfall zu entsorgen.

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lemmi
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Re: Botanische Mikrotechnik und Pflanzenpathogene

Beitrag von lemmi »

Wow, das ist ja schon die Oberliga der Mikroskopie! Das muss ich mir ein paar mal durchlesen, bevor ich was dazu sagen kann ...

Mein Erster Gedanke: hast du vielleicht noch Fotos von der makroskopischen Erscheinung der von dir mikroskopisch dargestellten Parasiten/Pilz-befallenen Pflanzen? Das fände ich zur Veranschaulichung sehr schön.
"Alles sollte so einfach wie möglich gemacht werden. Aber nicht einfacher." (A. Einstein 1871 - 1955)

"Wer nur Chemie versteht, versteht auch die nicht recht!" (G.C. Lichtenberg, 1742 - 1799)

"Die gefährlichste Weltanschauung ist die Weltanschauung der Leute, die die Welt nie gesehen haben." (Alexander v. Humboldt, 1769 - 1859)

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mgritsch
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Re: Botanische Mikrotechnik und Pflanzenpathogene

Beitrag von mgritsch »

Wow, ich bin beeindruckt!
Ich habe auch immer gerne mikroskopiert, zu solchen Fixier- und Färbemethoden bin ich aber nie gekommen. Und letztendlich scheitert es dann auch an der Möglichkeit entsprechend dünne Schnitte anzufertigen - auch die frischeste Rasierklinge hat ihre Grenzen und das ganze erfordert echt viel Geduld und Übung... Wenn du dazu einschlägige Empfehlungen hast?

Alf
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Re: Botanische Mikrotechnik und Pflanzenpathogene

Beitrag von Alf »

Freut mich dass es gefällt.
Mein Erster Gedanke: hast du vielleicht noch Fotos von der makroskopischen Erscheinung der von dir mikroskopisch dargestellten Parasiten/Pilz-befallenen Pflanzen? Das fände ich zur Veranschaulichung sehr schön.
Ja musste die Bilder suchen und habe sie eingefügt :)

Wenn du dazu einschlägige Empfehlungen hast?
Handschnitte funktionieren an stabilen Gewebestücken sehr gut. Am besten eine Stabile Klinge verwenden (Rasiermesser, Cutterklingen) und am wichtigsten: Übung. Gut ist es auskeilende Schnitte zu erstellen, dann kann man sowohl die dreidimensionale Struktur an dickeren Stellen nachvollziehen und hat auch sehr dünne Abschnitte. Blätter zb. kann man zwischen Karottenstücken einklemmen (kein Styropor das verschleißt die Klingen).

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mgritsch
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Re: Botanische Mikrotechnik und Pflanzenpathogene

Beitrag von mgritsch »

Alf hat geschrieben:
Mittwoch 20. Januar 2021, 11:09
Handschnitte funktionieren an stabilen Gewebestücken sehr gut. Am besten eine Stabile Klinge verwenden (Rasiermesser, Cutterklingen) und am wichtigsten: Übung. Gut ist es auskeilende Schnitte zu erstellen, dann kann man sowohl die dreidimensionale Struktur an dickeren Stellen nachvollziehen und hat auch sehr dünne Abschnitte. Blätter zb. kann man zwischen Karottenstücken einklemmen (kein Styropor das verschleißt die Klingen).
ich habe mir mal eine Art "mini-handmikrotom" gebastelt indem ich einfach eine Mutter auf eine Schraube gebe, nur wenige Umdrehungen. In den Hohlraum lege ich das Präparat und fülle alles mit Wachs aus. Nach dem Erhärten des Wachses kann man mit kleinen Umdrehungen den Wachsblock stückchenweise herausdrehen und über die Stirnfläche der Mutter geführt dünne Schnitte machen. Ein M6 ist halt ein für die Zwecke eher grobes Gewinde, aber durch das Wachs lassen sich auch ganz kleine Teil-Umdrehungen einigermaßen gut hinbekommen. Steigung 1 mm = mit 1/10 Umdrehung sollte man 1/10 mm dick schneiden...

Theoretisch soweit nicht mal so übel, praktisch ist das größte Problem dass die biologischen Proben idR einfach zu weich sind und mehr gequetscht als sauber geschnitten werden. Um eine Entwässerung/Fixierung kommt man wohl nicht drum rum und das ist aufwändig... :roll:

Cutterklingen? sind die nicht etwas zu grob und vor allem zu dick (und haben somit einen zu steilen Keil an der Schnittfläche)? Sonst benutze ich einfach die 08/15 Rasierklingen ... könnte man ggfs öfter mal eine frische benutzen :mrgreen:

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mgritsch
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Re: Botanische Mikrotechnik und Pflanzenpathogene

Beitrag von mgritsch »

edit: Korrekturgelesen und verschoben.

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