Unsere Arbeitsgruppe möchte in diversen Geweben die 1-alpha-Hydroxylase-Aktivität messen, dazu werden Nieren Mitochondrien isoliert und mit 25-Hydroxyvitamin D3 bei 37°C inkubiert.
Problem dabei ist, dass dann der Extrakt sich mit dem RIA http://www.idsplc.com/products/125-dihy ... min-d-ria/ was ich da habe nicht messen lässt. D.h. die Proben müssten per SPE (C18) auf gereinigt vgl. http://www.jasco.hu/4tgrdvxgv/uploads/2 ... -1021A.pdf und bei der Elution die "Recovery-Rate" bestimmt werden.
Perkin Elmer will für 5 µCi 1α,25-[26,27-3H]-Dihydroxyvitamin D3 4399.30 CHF haben, was für etwas was nur einige Monate hält und preislich jenseits von gut und böse liegt.
Meine Lösung für den internen Tracer wäre:
Eine größere Menge von Nieren Mitochondrien aus der Ratte zu isolieren und mit 25-[26,27-3H]-Hydroxyvitamin D3 zu inkubieren. Das 25-[26,27-3H]-Hydroxyvitamin D3 gibt es für 1435 CHF für 5 µCi, was erheblich billiger als der aktive Metabolit (1,25-Dihydroxvitamin D3) ist.
Würde diesen Extrakt dann über die "ISOLUTE SPE Column MFC18" vgl "IST-1021A.pdf" auf reinigen und per Scintillation Counter den Gehalt an 1α,25-[26,27-3H]-Dihydroxyvitamin D3 bestimmen und von dem Stock dann ein Aliquot als internen Tracer-Standard einsetzen. Laut einem Paper wird 5000 cpm 1α,25-[26,27-3H]-Dihydroxyvitamin D3 als Standard vor der Aufreinigung der Proben zugesetzt, was bei 168 Ci/mmol 0.225 nCi entsprechen sollte.
Meinungen erbeten....
Bj68
Radioaktiver interner Standard
Moderator: Moderatoren
Klingt eigentlich ganz gut. Allerdings sollte man vorher einen oder besser mehrere Testruns mit nicht-tritiierterm Substrat laufen lassen. um zu schauen wie gut das ganze klappt und das Verfahren "kennenzulernen" und zu optimieren.
I❤OC
There is no sadder sight in the world than to see a beautiful theory killed by a brutal fact. [T. Huxley]
The pursuit of knowledge is hopeless and eternal. Hooray! [Prof. H. J. Farnsworth]
Trust the rhythm and the rhyme of your own heartbeat. [C. Douglas]
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Die sind schon gelaufen, mit Nieren-Extrakten von Experimentalmäusen ca. 100 Stück Blindproben (ohne Substrat) und mit Substrat. Gemessen wurden diese auch und einen fetten Unterschied zwischen Blank (Blind) und Positiv gab es, nur:
a) sprangen die Werte hin und her...
b) eine Probe hatte gar nichts drin, obwohl positiv...später ist mir aufgefallen, dass bei der Reaktion am Ende 2 Phasen sind, da die Reaktion im Protokoll mit ACN gestoppt wird....wahrscheinlich die falsche Phase erwischt.
c) Bei einer Wiederholung zeigten 2 Werte ein anderes Ergebnis...
d) Müssen die Proben delipidiert werden (Dextransulfat) und da habe ich meine Zweifel ob das mit den Organextrakten so gut geht...Plasma ist halt anders...
Bj68
a) sprangen die Werte hin und her...
b) eine Probe hatte gar nichts drin, obwohl positiv...später ist mir aufgefallen, dass bei der Reaktion am Ende 2 Phasen sind, da die Reaktion im Protokoll mit ACN gestoppt wird....wahrscheinlich die falsche Phase erwischt.
c) Bei einer Wiederholung zeigten 2 Werte ein anderes Ergebnis...
d) Müssen die Proben delipidiert werden (Dextransulfat) und da habe ich meine Zweifel ob das mit den Organextrakten so gut geht...Plasma ist halt anders...
Bj68
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Bortribromid
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