Quantitative Analyse von Koffein in Kaffee und Tee über GC-FID

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EDTA
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Quantitative Analyse von Koffein in Kaffee und Tee über GC-FID

Beitrag von EDTA »

Quantitative Analyse von Koffein in Kaffee und Tee über GC-FID

Es wird die Bestimmung des Koffeingehalts über GC-FID mit Menthol als interner Standard von Filterkaffee, Instant-Kaffee und Schwarztee beschrieben. Es wurden 0.47 mg/mL Koffein im Filterkaffee, 0.25 mg/mL im Instant-Kaffee und 0.13 mg/mL im Schwarztee gefunden.

Instrumentation und Messmethode

Alle Messungen wurden an einem HP 5890A GC-FID, ausgerüstet mit einer HP-5 Säule (5% Phenylmethylpolysiloxan, 25 m x 0,2 mm x 0,11 µm) und der Software Unichrom® durchgeführt. Die 1 µL Injektionen wurden manuell unter Verwendung einer Hamilton #95 5 µL Mikroliterspritze durchgeführt.

Die Messbedingungen waren: Ofentemperatur bei 50 °C für 2 min, dann 25 °C/min bis 275 °C für 1 min. Inlet/Detektor waren bei 275 bzw. 300 °C. Der Säulenvordruck von 4 PSI ergab einen Fluss von 1 mL/min Wasserstoff, woraus sich bei 3 mL/min Septum Purge und 30 mL/min Split Vent Flow ein Split-Verhältnis von 30:1 ergibt.

Geräte:

25 mL und 10 mL Messkolben mit Stopfen, diverse Mess- und Vollpipetten, Pasteurpipetten, Vials, Analysenwaage, Mikrospatel

Chemikalien:

Aceton (GC-FID/ECD grade) Warnhinweis: f

Koffein (p.a.) Warnhinweis: attn

Menthol (p.a.) Warnhinweis: attn

Durchführung:

Probenvorbereitung und Peak-Identifizierung

Es wurden 50.0 mg Koffein und 12.5 mg in je einen 25 mL Messkolben eingewogen und mit Aceton bis zur Eichmarke aufgefüllt. Durch Messung dieser beiden Standard-Lösungen ergaben sich folgende Retentionszeiten:

Menthol: 7.14 min

Koffein: 11.17 min

1.0 mL Filterkaffe (4 EL Kaffeepulver auf 10 Tassen Wasser) und je 2.0 mL Instant-Kaffee (1 TL auf 220 mL Wasser) bzw. Schwarztee (1 Teebeutel auf 220 mL Wasser, 8 min Ziehzeit) wurden in einen 10 mL Messkolben zusammen mit 1 mL der Menthol Lösung pipettiert und mit Aceton bis zur Eichmarke aufgefüllt.

Quantifizierung

Aus der Koffein-Standard Lösung wurden Verdünnungen mit 0.01, 0.05, 0.10, 0.25, 0.50, 0.75 und 1.0 mg/mL hergestellt, die jeweils mit 0.50 mg interner Standard versehen waren. Durch Normieren des Koffeinpeaks über den internen Standard wurde eine Regressionsgerade mit dem Bestimmtheitsmaß R2 von 0.9996 erstellt.
Regressionsgerade.jpg
Regressionsgerade.jpg (22.88 KiB) 450 mal betrachtet
Chromatogramme:

Filterkaffee:
Filterkaffee.jpg
Instant-Kaffee:
Instantkaffee.jpg
Schwarztee:
Schwarztee.jpg
Schwarztee.jpg (31.03 KiB) 450 mal betrachtet
Entsorgung:

Alle Lösungen werden als wässriger, halogenfreier Abfall entsorgt.

Ergebnis und Diskussion:

Durch Berücksichtigung der vorhergehenden Verdünnung ergab sich für Filterkaffee ein Gehalt von 0.47 mg/mL Koffein im Filterkaffee, 0.25 mg/mL im Instant-Kaffee und 0.13 mg/mL im Schwarztee gefunden. Diese Werte liegen in dem durch Literaturrecherche ermittelten Erwartungsbereich.

Die tatsächliche Menge an Koffein in derartigen Produkten variiert natürlich stark mit der jeweiligen Zubereitung.

Bilder:
GC-FID.jpg

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mgritsch
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Re: Quantitative Analyse von Koffein in Kaffee und Tee über GC-FID

Beitrag von mgritsch »

Nice :) auch instrumentelle Analytik kann man zuhause machen und so ein GC-FID ist ein tolles „Working Horse“.

Wozu diente das Menthol wenn du Coffein als Standard für die Kalibrierung benutzen kannst?
Was könnte der Peak links davon bei 4,nochwas min sein?
Stört das Wasser (und andere braune Zeug…) nicht? Sollte/könnte man Coffein nicht im basischen nach Chloroform ausschütteln?
Liegt Coffein nicht teilweise glycosidisch gebunden vor und muss erst durch basischen Aufschluss freigesetzt werden um eine Aussage über Gesamtgehalt zu bekommen? Bei der Isolierung kocht man jedenfalls länger mit MgO…
Es wundert mich dass bei den Proben keine anderen Peaks auftreten… so Naturprodukte sind immerhin sehr bunte Mischungen…
Kann die GC Coffein von Theobromin trennen (Kakao…)?

Glaskocher
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Re: Quantitative Analyse von Koffein in Kaffee und Tee über GC-FID

Beitrag von Glaskocher »

Eine tolle Anwendung der GC mit internem Standard!
Ein solches Gerät ist ein guter "Arbeitsesel", der viele Möglichkeiten bietet. Im Labor will ich diese Möglichkeit nicht missen. Der FID ist ja einer der meistgenutzten Detektoren, weil er ziemlich robust ist und beim Übersteuern keine Schäden nimmt.

EDTA
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Re: Quantitative Analyse von Koffein in Kaffee und Tee über GC-FID

Beitrag von EDTA »

Wozu diente das Menthol wenn du Coffein als Standard für die Kalibrierung benutzen kannst?
Da ich keinen Autosampler habe, ist das Injektionsvolumen nicht zu 100 % reproduzierbar. Würde ich meine Kalibriergerade nur auf die absolute Fläche des Koffeinpeaks beziehen, würden diese Ungenauigkeiten sehr ins Gewicht fallen. Ich beziehe mich daher auf das Signal- und Konzentrationsverhältnis zwischen Koffein und Menthol und gleiche diese Ungenauigkeit aus.
Was könnte der Peak links davon bei 4,nochwas min sein?
Keine Ahnung. Ich mache zuvor immer einen "System blank" Durchlauf (also ohne Injektion), da war der Peak nicht zu sehen. Beim anschließenden "Solvent Blank" tauchte er auf - also entweder stammt die Substanz aus dem Lösungsmittel oder den verwendeten Kunststoffprodukten (Spritzen, Vials, Septen, etc.). Aufgrund der Intensität tippe ich aber auf das Lösungsmittel.
Stört das Wasser (und andere braune Zeug…) nicht? Sollte/könnte man Coffein nicht im basischen nach Chloroform ausschütteln?
Auf Wasser schlägt der FID nicht an und auch die Säulen halten Wasser ohne Probleme aus. Würde man sehr korrekt arbeiten wollen, könnte man natürlich die Standard-Lösungen mit der selben Menge Wasser versehen, die später in den Probenlösungen enthalten ist.

Das braune Zeug stört natürlich und verdreckt irgendwann das System (zumindest den Liner). Ich habe daher die Probe 1/10 verdünnt - das schafft schon Abhilfe. Aber in der Routineanalytik mit über 100 Proben die Woche würde ich mehr Sorgsamkeit auf die Probenvorbereitung legen. Ich analysiere ca. 5 Proben im Monat, wenn da ein paar dabei sind, die nicht sauber sind, fällt das - zumindest bei meinen Ansprüchen - wenig ins Gewicht.

Ich wollte eine Flüssig/Flüssig Extraktion vermeiden, da diese entweder quantitativ ablaufen oder der Probenverlust quantifizierbar sein muss. Letzteres könnte man über GC/MS mit isotopenmakiertem Koffein als internen Standard durchaus bewerkstelligen - aber das sprengt wohl etwas den Rahmen eines Heimlabors.
Liegt Coffein nicht teilweise glycosidisch gebunden vor und muss erst durch basischen Aufschluss freigesetzt werden um eine Aussage über den Gesamtgehalt zu bekommen? Bei der Isolierung kocht man jedenfalls länger mit MgO…
Ich habe ein paar Paper gelesen, die die Bestimmung von Koffein beschreiben. Meistens wird eine Flüssig/Flüssig Extraktion durchgeführt - ein Aufschluss mit MgO war nie dabei.
Es wundert mich dass bei den Proben keine anderen Peaks auftreten… so Naturprodukte sind immerhin sehr bunte Mischungen…
Kann die GC Coffein von Theobromin trennen (Kakao…)?
Der Kaffee ist eine bunte Mischung. Das Chromatogramm wurde so skaliert, dass die beiden interessanten Signale gut zu sehen sind. So schaut das ganze nahe der Basislinie aus:

InstantKaffee2.jpg

Das sollte trennbar sein. Aber da ich kein reines Theobromin zur Hand habe, finde ich den entsprechenden Peak nicht.

EDTA
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Re: Quantitative Analyse von Koffein in Kaffee und Tee über GC-FID

Beitrag von EDTA »

@Glaskocher: Vielen Dank!
Ich bin sehr glücklich mit diesem Gerät und den dadurch gewonnenen Möglichkeiten. Ein paar der Versuche werden wohl hier noch im Forum landen :wink: . Die Nachweisstärke und die enorme Auflösung der GC mit Kapillarsäulen ist für mich noch immer kaum zu begreifen. Und doch ist der FID im Vergleich zu einem MS im SIM Modus weit weg...

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mgritsch
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Re: Quantitative Analyse von Koffein in Kaffee und Tee über GC-FID

Beitrag von mgritsch »

Dankeschön für die Erklärungen, macht Sinn. Könnte man auch noch in den Artikel mit übernehmen :)

Das einzige was mich wirklich wundert ist das Verhältnis von Koffein zum Rest. Wenn alles andere irgendwo im Hintergrund grundelt bedeutet das, dass trinkbarer Kaffee eine fast reine Koffeinlösung ist, nur mit Spurenverunreinigungen?

Glaskocher
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Re: Quantitative Analyse von Koffein in Kaffee und Tee über GC-FID

Beitrag von Glaskocher »

Könnte der "4-Minuten-Peak" ein Aldol-Kondensat des Acetons sein, wenn es mit dem "leeren" Lösemittel auch kommt? Zumindest erscheint das logisch.

Manchmal ist mir der FID sogar lieber als ein MS, gerade wegen der etwas "robusteren" Charakteristik. Derzeit habe ich nur den MS Detektor zur Auswahl. Da muß ich schon ziemlich mit der Konzentration aufpassen, um ihn nicht zu übersteuern. Das MS ist natürlich von großem Vorteil, weil man dann unbekannten Peaks eine Molmasse oder zumindest ein "Bröselspektrum" zuordnen kann, das mit etwas Glück in einer Datenbank findbar ist.

EDTA
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Re: Quantitative Analyse von Koffein in Kaffee und Tee über GC-FID

Beitrag von EDTA »

Das einzige was mich wirklich wundert ist das Verhältnis von Koffein zum Rest. Wenn alles andere irgendwo im Hintergrund grundelt bedeutet das, dass trinkbarer Kaffee eine fast reine Koffeinlösung ist, nur mit Spurenverunreinigungen?
Jain. Ich sehe in der GC nur (bei 275 °C) verdampfbare Verbindungen. Das schränkt natürlich stark ein. Dann ist das Ansprechverhalten des Detektors zu beachten: Im 0,05 mg/mL Standard ist dieselbe Masse an Koffein wie Menthol vorhanden, dennoch weist der Koffein-Peak nur die halbe Fläche auf.

Aber wenn man von diesen "Feinheiten" absieht und es nur um Größenordnungen geht, mag Kaffee wirklich nur Koffeinlösung mit etwas Spurenverunreinigung sein. Wenn man darüber nachdenkt, dass Kaffeebohnen bis zu 4 % Koffein enthalten können, ist das bei genauerer Betrachtung nicht verwunderlich.

EDTA
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Re: Quantitative Analyse von Koffein in Kaffee und Tee über GC-FID

Beitrag von EDTA »

@Glaskocher: Könnte durchaus sein. Da wäre jetzt ein MS praktisch :angel:
Aber eine durch Unachtsamkeit in das Gebinde eingebrachte Verunreinigung würde ich nicht ausschließen...

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mgritsch
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Re: Quantitative Analyse von Koffein in Kaffee und Tee über GC-FID

Beitrag von mgritsch »

EDTA hat geschrieben:
Samstag 7. August 2021, 17:34
Ich sehe in der GC nur (bei 275 °C) verdampfbare Verbindungen. Das schränkt natürlich stark ein.
das ist vermutlich die logischste Erklärung. Coffein sublimiert leicht, der Rest klebt noch im Verdampfer...
Aber wenn man von diesen "Feinheiten" absieht und es nur um Größenordnungen geht, mag Kaffee wirklich nur Koffeinlösung mit etwas Spurenverunreinigung sein. Wenn man darüber nachdenkt, dass Kaffeebohnen bis zu 4 % Koffein enthalten können, ist das bei genauerer Betrachtung nicht verwunderlich.
also geschmacklich dürfte die Koffeinlösung an den Kaffee wohl kaum rankommen :) (von einem Versuch zur Verifizierung sehe ich jetzt mal ab). Kommt vermutlich auch drauf an ob man "Kaffffe" oder "Kaffeeee" vorliegen hat :yeah:

Kannst du headspace mit deinem Gerät?
Wäre cool mal etwas Luft aus dem Kaffeepäckchen anzusaugen...

EDTA
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Re: Quantitative Analyse von Koffein in Kaffee und Tee über GC-FID

Beitrag von EDTA »

mgritsch hat geschrieben:
Samstag 7. August 2021, 17:54
Kannst du headspace mit deinem Gerät? Wäre cool mal etwas Luft aus dem Kaffeepäckchen anzusaugen...
Leider kann ich sowas nicht machen. In einem professionellen Labor würde man eine Head-Space Festphasenmikroextraktion (HS-SPME) durchführen, dafür fehlt mir das Equipment.

Außerdem müsste ich mangels MS schon wissen nach was ich suche - und die Vergleichssubstanz auch im Schrank haben.

Vanadiumpentoxid
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Re: Quantitative Analyse von Koffein in Kaffee und Tee über GC-FID

Beitrag von Vanadiumpentoxid »

mgritsch hat geschrieben:
Samstag 7. August 2021, 17:54
Kommt vermutlich auch drauf an ob man "Kaffffe" oder "Kaffeeee" vorliegen hat :yeah:
Heißen die bei Dir zu Hause nicht eher kleiner oder größer Scharzer/Brauner?
Gott gebe mir die Kraft, zu ändern, was ich verändern kann,
die Gelassenheit, hinzunehmen, was ich nicht verändern kann,
und die Weisheit, das eine vom anderen zu unterscheiden.
_______________________________________________

Ist das noch o. k. oder auch schon wieder zu viel?...

Sebacylbrause
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Re: Quantitative Analyse von Koffein in Kaffee und Tee über GC-FID

Beitrag von Sebacylbrause »

Sehr cool, darf ich fragen was du bezahlt hast und wo du gekauft hast? Wurde die als gebraucht angeboten oder ala refurbished? Und woher beziehst du den Wasserstoff und in welcher Reinheit?

EDTA
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Re: Quantitative Analyse von Koffein in Kaffee und Tee über GC-FID

Beitrag von EDTA »

Bezahlt habe ich für den GC 500€ in gebrauchtem Zustand. Aber ich hatte sehr großes Glück, da viel Zubehör (Druckminderer, Kupferleitungen, Säulen, Liner, Septen und Mikroliterspritzen) inkludiert war. Allerdings war kein PC dabei und die Chromatogramme wurden auf Thermopapier ausgedruckt.

Die Details stehen hier beschrieben: viewtopic.php?f=32&t=5520

Die neue Platine mit RS232 Schnittstelle kostete ca. 250€. Dann waren noch Adapter und ein Nullmodemkabel erforderlich. Die Software kostet ca. 600€, was aber im Vergleich zu Agilent Chemstation ein Schnäppchen ist.

Wasserstoff kann man tatsächlich als Privatperson ohne Auflagen kaufen (https://gase-kaufen.de/) - ich verwende jedoch "nur" Wasserstoff 3.0. Man sieht im gezeigten Chromatogramm übrigens einen relativ starken Anstieg der Basislinie - das ist durch zu viel Sauerstoff im Trägergas verursacht. 5.0 wäre besser, aber deutlich kostspieliger. Zusätzlich ist synthetische Luft (ca. 200€ pro Flasche - hält für 90 h Messdauer) und Stickstoff (keine Ahnung wie viel der kostet - ist eine "dauerhafte Leihgabe") erforderlich.

Da sehr hohe Reinheitsanforderungen an die Lösungsmittel gestellt sind, darf man diese im Preis nicht unterschätzen - es hängt aber dann stark davon ab, wie viel und was man tatsächlich macht.

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mgritsch
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Re: Quantitative Analyse von Koffein in Kaffee und Tee über GC-FID

Beitrag von mgritsch »

EDTA hat geschrieben:
Samstag 7. August 2021, 20:36
Man sieht im gezeigten Chromatogramm übrigens einen relativ starken Anstieg der Basislinie - das ist durch zu viel Sauerstoff im Trägergas verursacht.
Über GC muss ich (zu meiner Schande… sollte ich besser wissen) noch einiges lernen. Warum ist das so? Ich dachte wenn das im Trägergas ständig mit läuft dann stellt sich bald mal ein GG ein und das war’s dann… Schlägt O2 im FID überhaupt an? Immerhin ist er ständig präsent für die Verbrennung… oder sind das alle möglichen anderen Verunreinigungen die langsam die Säule sättigen und dann durchbrechen?
Da sehr hohe Reinheitsanforderungen an die Lösungsmittel gestellt sind, darf man diese im Preis nicht unterschätzen
Allerdings, umso verwunderlicher dass dein Aceton so einen Peak mit bringt :conf:

Weiters:
einen Fluss von 1 mL/min Wasserstoff, woraus sich bei 3 mL/min Septum Purge und 30 mL/min Total Flow ein Split-Verhältnis von 30:1 ergibt.
Also mit Blick auf https://hrgc.eu/Images/gc_injector.jpg
Ist das Split-Verhältnis nicht „nach septum purge“ definiert, somit in deinem Fall 26:1? Das wäre jedenfalls die effektiv wirksame Verdünnung.

Zur Idee wegen headspace - klar, ohne Vergleichssubstanzen ist es im trüben fischen und nicht identifizierbar, von quantitativ reden wir mal nicht, Aber mal nur so als „Gag“ - was würde raus kommen wenn du mit einer Spritze etwas „Kaffeeduft“ aus der Luft in einer Packung entnimmst und in den liner injizierst?

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