Analyse von Pharmaka (II) - Identifizierung durch systematische Dünnschichtchromatographie

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lemmi
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Analyse von Pharmaka (II) - Identifizierung durch systematische Dünnschichtchromatographie

Beitrag von lemmi »

Analyse von Pharmaka (II) - Identifizierung durch systematische Dünnschichtchromatographie

Im Folgenden werden die Grundlagen der systematischen DC vorgestellt, wie sie in der Pharmazie und Toxikologie zur Identifizierung unbekannter Stoffe angewandt wird. Das Vorgehen ist dem maßgeblichen deutschsprachigen Lehrbuch zur Arzneimittelanalyse, dem “Auterhoff-Kovar“[1], entnommen. Das Prinzip besteht darin, den isolierten Wirkstoff nacheinander mit bestimmten Fließmitteln gemeinsam mit bestimmten Referenzsubstanzen zu chromatographieren, und aus dem Laufverhalten der Substanz relativ zu den Referenzen die Auswahl möglicher Kandidaten einzuengen. Zwischen zwei Referenzsubstanzen laufende Stoffe bilden eine neue Untergruppe, die dann mit einem anderen Fließmittel und weiteren Referenzsubstanzen erneut chromatographiert wird. Durch Sprühreagenzien hervorgerufene Farbreaktionen helfen ebenfalls bei der Charakterisierung. Schließlich wird eine Identifizierung durch direkten DC-Vergleich mit den in die nähere Auswahl genommenen Kandidaten durchgeführt.

Der DC vorgeschaltet ist eine Extraktion des oder der Analyten aus dem vorgelegten Material, zum Beispiel einem Arzneimittel, und die Trennung und Anreicherung der möglichen Komponenten in 6 verschiedenen, chemisch definierten Fraktionen mit Hilfe des Stas-Otto-Trennungsgangs. Die DC-Identifizierung hat den großen Vorteil, dass wenige Milligramm Substanz für die Durchführung aller nötigen Analysen ausreichend sind. Daher sind die hier eingesetzten, gegenüber früheren Vorschriften deutlich kleineren, Mengen an Ausgangssubstanz und Lösungsmitteln ausreichend. Will man größere Mengen der Wirkstoffe in Substanz isolieren, z.B. um deren Schmelzpunkt zu bestimmen oder Identifizierungsreaktionen im Halbmikromaßstab durchzuführen, können die Mengen mit dem Faktor 3 multipliziert werden.

Das Vorgehen wird hier anhand der Analyse eines freiverkäuflichen Grippemittels demonstriert.


Material/Geräte:

Magnetheizrührer mit Wasserbad, kleine (30 ml) Soxhlet-Apparatur mit Rückflußkühler, 100 ml Rundkolben, Exsikkator, Analysenwaage, mehrere kleine Präparategläschen, Messzylinder 25 ml, Messpipette 10 ml, Kolbenhubpipette 500 und 1000 µl

DC-Ausrüstung: DC-Fertigfolien Kieselgel 60G 254F (10 x 5 cm), passende Schraubdeckelgläser (mit Fließpapier ausgekleidet), Mikroliterpipette (2-20 µl) mit auswechselbarer Spitze oder Kapillaren zum Auftragen der Substanzen, Sprühkopf, Sprühkammer, UV-Analysenlampe 254 und 365 nm

Daneben werden die zur Durchführung des Stas-Otto-Ganges notwendigen Geräte benötigt.


Chemikalien:

Methanol Warnhinweis: fWarnhinweis: tWarnhinweis: xn
Ammoniaklösung 25% Warnhinweis: nWarnhinweis: cWarnhinweis: t
Aceton Warnhinweis: fWarnhinweis: attn
Ethylacetat Warnhinweis: fWarnhinweis: attn
2-Propanol Warnhinweis: fWarnhinweis: attn
1-Butanol Warnhinweis: fWarnhinweis: attnWarnhinweis: c
Toluol Warnhinweis: fWarnhinweis: attnWarnhinweis: xn
Ameisensäure Warnhinweis: tWarnhinweis: cWarnhinweis: f
Essigsäure Warnhinweis: cWarnhinweis: f
n-ButylacetatWarnhinweis: fWarnhinweis: attn
n-Heptan Warnhinweis: fWarnhinweis: attnWarnhinweis: xnWarnhinweis: n

Aufgeführt sind hier aus Platzgründen nur die für die Fließmittel notwendigen Lösungsmittel. Daneben werden Sprühreagenzien für die DC und mehrere Referenzsubstanzen benötigt, weiter die zur Durchführung des Stas-Otto-Ganges notwendigen Geräte und Chemikalien.


Versuchsdurchführung:

1. Extraktion der Pharmaka und Trennungsgang:

Analysiert wurde “BoxagrippalR“, ein rezeptfrei erhältliches Arzneimittel gegen Erkältungssymptome. Die deklarierten Wirkstoffe sind 200 mg Ibuprofen und 30 mg Pseudoephedrinhydrochlorid pro Tablette. An Hilfsstoffen sind laut Beipackzettel Lactose-1-Wasser, mikrokristalline Zellulose, Carboxymethylstärke-Na Typ A, Siliciumdioxid, Magnesiumstearat, Polyvinylalkohol, Titandioxid, Macrogol 3350 und Talkum enthalten.

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Boxagrippal Schachtel.jpg (65.53 KiB) 248 mal betrachtet
Abb.: Boxagrippal

Zunächst mussten die Wirkstoffe von den Hilfsstoffen getrennt werden. Dazu wurden 2 Tabletten Boxagrippal fein zerrieben und in einer kleinvolumigen Soxhlet-Apparatur auf dem Wasserbad mit 50 ml Methanol 4 Stunden lang extrahiert (ein Zyklus dauert 10-12 Minuten). Aus dem klaren, methanolischen Extrakt wurde dann auf dem Wasserbad das Lösungsmittel abdestilliert. Es blieb ein weißer Rückstand, der nach dem Erkalten (im Exsikkator) aus dem Kolben gekratzt und gepulvert wurde. Erhalten wurden 510 mg. Das sind mehr als die erwarteten 460 mg, wahrscheinlich ist auch etwas Polyvinylakohol mit in den Extrakt übergegangen.

Soxhlet 1.jpg
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Abb. Extraktion im Soxhlet

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Abb. Abdestillieren des Methanols

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Extraktionsrückstand 2.jpg (47.24 KiB) 248 mal betrachtet
Abb. Rückstand

Von der extrahierten Substanz wurden 50 mg dem Stas-Otto-Trennungsgang unterworfen, der im Folgenden nochmals als Flussdiagramm dargestellt ist.
Trennungsgang-Flussschema 1.jpg
Trennungsgang-Flussschema 2.jpg
Auf eine Auftrennung des schwefelsauren Etherauszuges in die Fraktionen IA und IB wurde verzichtet, da keine Neutralstoffe zu erwarten waren. Erhalten wurden somit nur 5 Fraktionen (I bis V). Aus den organischen Phasen wurde das Lösungsmittel abdestilliert und durch Wägen der Kolben der erhaltene Rückstand bestimmt. Gefunden wurden:

Fraktion I: zunächst sirupöser Rückstand der beim Stehenlassen im Exsikkator über Nacht kristallin erstarrt: 38 mg (soweit möglich aus dem Kolben gekratzt und 5 mg in 1 ml Methanol gelöst)
Fraktion II: minimaler feintropfiger Anflug an der Kolbenwand, nicht wägbar (in 0,5 ml Methanol gelöst)
Fraktion III: eisblumenartiger, die Kolbeninnenwand überziehender Film: 7 mg (in 2 ml Methanol gelöst)
Fraktion IV: kein sichtbarer Rückstand (Kolben mit 0,2 ml Methanol ausgespült)
Fraktion V, auf der Heizung über Nacht eindunsten gelassen: weißer, kristalliner Rückstand: 167 mg (mit 1 ml Methanol verrührt)

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Abb. Fraktionen I-V nach dem Trennungsgang

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Rückstand Fraktion III.jpg
Rückstand Fraktion III.jpg (66.96 KiB) 248 mal betrachtet
Abb. Rückstand der Fraktionen I (oben) und III (unten)

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Fraktionen I-V zur DC.jpg (75.83 KiB) 248 mal betrachtet
Abb. Lösungen für die DC, ganz links die aus Fraktion I gewonnene Substanz

Um festzustellen, welche der Fraktionen überhaupt eine Substanz gelöst enthalten, wurden sie zunächst einer orientierenden DC mit einem “Universal-Fließmittel“ unterzogen, das zahlreiche sowohl saure als auch basische Pharmaka gut trennt[2]. Es besteht aus Ethylacetat + Methanol + Ammoniaklösung 25% (8,5 + 1,0 + 0,5). Aufgetragen wurden je 2 µl der 5 Fraktionen. Die Entwicklungszeit dauert bei Kammersättigung rund 18 Minuten.

Um vorhandene Spots zu detektieren wurden nacheinander drei Verfahren angewandt:

1. Prüfung auf Fluoreszenzlöschung im kurzwelligen UV-Licht (254 nm)
2. Behandlung mit Iod-Dampf in der Iodkammer
3. Besprühen (nach gründlichem Abdunsten des Iods) mit alkalischer Kaliumpermanganatlösung. Es muss einige Minuten gewartet werden, da manche Spots erst nach einiger Zeit erscheinen und eventuell nur blass sichtbar werden.

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Orientierende DC2.1x.jpg (15.85 KiB) 180 mal betrachtet
Abb. orientierende DC unter UV 254 nm; aufgetragen sind v.l.n.r. Fraktion I – II – III – IV und V

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Orientierende DC2.2x.jpg (14.77 KiB) 180 mal betrachtet
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Orientierende DC2.3x.jpg (22.8 KiB) 180 mal betrachtet
Abb. orientierende DC nach Bedampfen mit Iod (oben) und Besprühen mit alkalischer Permanganatlösung (unten)

In Fraktion I findet sich ein Spot, der eine relativ schwache Fluoreszenzlöschung zeigt, sich mit Iod blass anfärbt und mit Permanganat erst nach einigem Warten reagiert. Die Fraktion III enthält einen kleinen Spot, der im UV nicht sichtbar ist, sich mit Iod beim genauen hinsehen blass anfärbt und Kaliumpermanganat-positiv ist. Fraktion V zeigt einen großen, nicht fluoreszenzlöschenden, sofort Permanganat-positiven Spot auf der Startlinie (die beim Trennungsgang zugesetzte Weinsäure). Die Fraktionen II und IV sind leer.


2. Systematische DC zur Identifizierung der Substanzen:

Referenzsubstanzen: Für die jetzt folgenden DCs werden zahlreiche Arzneistoff-Referenzen benötigt. Sie werden zu 2 mg/ml (schlecht fluoreszenzlöschende, wie Atropin, in höherer Konzentration von 4 mg/ml) in Methanol gelöst. Wo keine Referenzsubstanzen zur Verfügung stehen kann eine Tablette eines entsprechenden Arzneimittels fein gepulvert mit Methanol mazeriert werden, so dass eine Lösung der o.g. Konzentration resultiert. Die Lösungen sind im Kühlschrank für einige Zeit haltbar (manche wie Warfarin und Omeprazol zersetzen sich relativ rasch und müssen neu angesetzt werden). Sudan III markiert jeweils das obere Ende des in Frage kommenden Rf-Bereiches.

Zur Identifikation der Substanz in Fraktion I wurde diese - dem Lehrbuch folgend - zuerst einer DC mit einem Fließmittel unterworfen, das aus 2-Propanol + Toluol + Ammoniaklösung 25% (6 + 3 + 1) besteht, Furosemid, Propylthiouracil und Warfarin werden als Referenzsubstanzen mitgeführt. Die Entwicklung dauert fast eine Stunde. Alle Substanzen sind gut durch ihre Fluoreszenzminderung erkennbar.

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DC Fraktion I.1x.jpg (15.07 KiB) 180 mal betrachtet
Abb. erste DC der Fraktion I; v.l.n.r. Fraktion I – Furosemid – Propylthiouracil – Warfarin – Sudan III

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Abb. Darstellung der Untergruppen I.1 und I.2 aus dem Lehrbuch von Auterhoff-Kovar[1] (verändert)

Nun kommt das Untergruppenschema zur Anwendung: Unterhalb des Warfarins laufende Stoffe zählen zur Untergruppe I.1, oberhalb von Propylthiouracil laufende zur Gruppe I.2. Die teilweise Überlappung trägt der Variabilität der Rf-Werte Rechnung. Die in Fraktion I enthaltene Substanz gehört eindeutig zur Gruppe I.1. In der Region auf etwa 2/3 der Strecke zwischen Furosemid und Propylthiouracil liegen neben ein paar anderen Stoffen die NSAR (nichtsteroidalen Antirheumatika) Indometacin, Ibuprofen und Diclofenac.
Im zweiten Schritt wird die Fraktion I mit dem Fließmittel für die Untergruppe I.1 (Toulol + Aceton + Ameisensäure = 6 + 3,9 + 0,1) und neuen Referenzsubstanzen chromatographiert (Entwicklungszeit 25 Minuten)

DC Fraktion I.2x.jpg
DC Fraktion I.2x.jpg (13.47 KiB) 180 mal betrachtet
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DC Fraktion I.2b x.jpg (27.56 KiB) 180 mal betrachtet
Abb. DC der Fraktion I, Untergruppe 1; v.l.n.r. Saccharin – Indometacin – Diclofenac – Fraktion I – Sudan III;
oben: im UV 254, unten: nach Behandeln mit Vanillin-Schwefelsäure

Die Substanz in I läuft zwischen Indometacin und Sudan III und etwa auf Höhe des Diclofenacs. In dieser Zone kommen Flufenaminsäure, Mefenaminsäure, Diclofenac und Benzoesäure in Frage – bis auf die letztere sämtlich NSAR. Eine weitere Eingrenzung wurde durch Anwendung eines Sprühreagenzes vorgenommen. Mit Vanillin-Schwefelsäure (nach dem Besprühen 5 Minuten auf 100 °C erhitzen) sollten sich die ersten beiden ebenso wie Indometacin graubraun anfärben, Diclofenac wird gelb gefärbt. Die Substanz I bleibt aber ungefärbt, was in dieser Region nur auf Benzoesäure und Ibuprofen zutrifft. Die flaue Fluoreszenzlöschung passt außerdem besser zu Ibuprofen.

Aut-Kov I.1.jpg
Abb. Analyse der Untergruppe I.1 aus dem Lehrbuch von Auterhoff-Kovar[1] (verändert)

In die nähere Auswahl kommen also Ibuprofen und Benzoesäure, vielleicht noch Diclofenac. Die DC-Identifizierung erfolgt jetzt nach dem TAV-Schema. T steht hier für “Testsubstanzen“ mit denen der RF-Bereich abgesteckt wird, in dem sich die Analysensubstanz (A) zu bewegen hat. V1 und V2 markieren die Vergleichssubstanzen. Wenn der Analyt mit einer Vergleichssubstanz identisch ist, läuft er nicht nur auf derselben Höhe, sondern bildet, zusammen mit der Substanz aufgetragen, nur einen distinkten Spot, während sich differente Stoffe während der DC trennen. Das Auftragsschema lautet:

T1 –V1 – V1A – A – V2A – V2 – T2

In diesem Schritt ist die Wahl des Fließmittels frei. Man sucht sich ein solches, das die in Frage kommenden Kandidaten gut trennt (anhand der Literatur [3],[5],[6]) und kann dann auf die untere und obere Testsubstanz verzichten. Ich habe ein Fließmittel gewählt, das zur Trennung von NSAR angegeben wird: Heptan + Eisessig + Butylacetat (8,5 + 1,0 + 0,5), die Trennung dauert nur knapp 15 Minuten[6].

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Identifzierung Diclo - Benzoesäure - Ibu x.jpg (15.69 KiB) 180 mal betrachtet
Abb. DC der Fraktion I nach dem TAV-Schema, v.l.n.r. Diclofenac – Diclofenac + Fraktion I - Benzoesäure – Benzoesäure + I – Ibuprofen - Ibuprofen + I

Die Substanz I trennt sich deutlich von Diclofenac und läuft aber auf derselben Höhe wie Ibuprofen. Die Trennung von der Benzoesäure ist weniger deutlich (Spur 4), aber im Vergleich zu reiner Benzoesäure (Spur 3) ist sie dennoch zu erkennen. Hier würde man ggf einen zweiten Versuch mit einem anderen Laufmittelgemisch machen. Es handelt sich also um Ibuprofen. Da von der Substanz I noch genügend übrig war, habe ich außerdem eine Schmelzpunktbestimmung durchgeführt. Auch der gefundene Wert von 74 °C passt zu Ibuprofen (Literatur 75 - 77 °C; Schmelzpunkt Benzoesäure: 122 °C). Zusätzlich könnte man noch Farbreaktionen auf der Tüpfelplatte durchführen.

Die Identifikation der Substanz in Fraktion III erfolgt in der ersten Stufe mit demselben Fließmittel, das für die orientierende DC verwendet wurde (Ethylacetat + Methanol + Ammoniaklösung = 8,5 + 1,0 + 0,5). Als Referenzen dienen Atropin, Ethylmorphin und Ambroxol. Außerdem wird die schon identifizierte Substanz - Ibuprofen – mitgeführt um eine evtl. Kontamination der Fraktion aufzudecken.

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DC Fraktion III.1x.jpg (17.05 KiB) 180 mal betrachtet
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DC Fraktion III.1.2x.jpg (20.38 KiB) 180 mal betrachtet
Abb. DC der Fraktion III
v.l.n.r. Atropin + Ibuprofen – Ethylmorphin – Fraktion III – Ambroxol – Sudan III
oben: UV 254 nm; unten: nach Behandeln mit Ioddampf

Atropin ist in Spur I der obere Spot, der im UV kaum sichtbar ist (Ambroxol sieht man ebenfalls kaum, die Extraktion aus dem fertigarzneimittel war wohl nicht gut). Die Substanz III läuft zwischen Atropin und Ethylmorphin und ist offensichtlich nicht mit Ibuprofen identisch. Sie gehört damit zur Untergruppe III.1. In dieser Region finden sich die Ephedraalkaloide. Als Gruppenreagenz ist für die Fraktion III Dragendorff sehr geeignet. Allerdings sind die Ephedraalkaloide Dragendorff-negativ, ich habe die Folie daher mit Ninhydrin besprüht und 5 Minuten auf 100 °C erhitzt. Die positive Reaktion bestärkt den Verdacht, dass ein Ephedraalkaloid anwesend ist.

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Abb. Darstellung der Untergruppen III.1 bis III.3 aus dem Lehrbuch von Auterhoff-Kovar[1] (verändert)

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Orientierende DC1.2x.jpg (15.33 KiB) 180 mal betrachtet
Abb. DC der Fraktion III nach Behandeln mit Ninhydrin
v.l.n.r. Atropin + Ibuprofen – Ethylmorphin – Fraktion III – Ambroxol – Sudan III

Als nächstes kommt das Fließmittel für die Untergruppe III.1 zum Einsatz (Aceton + Ammoniaklösung = 9,6 + 0,4). Die Detektion habe ich gleich mit Ninhydrin durchgeführt.

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DC Fraktion III.2aa x.jpg (30.31 KiB) 180 mal betrachtet
Abb.: DC der Fraktion III, Untergruppe 1; v.l.n.r. Atropin – Omeprazol – Fraktion III – Cathin (Norpseudoephedin) - Sudan III

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Abb. Analyse der Untergruppe III.1 aus dem Lehrbuch von Auterhoff-Kovar[1] (verändert)

Die Substanz III hat einen hohen Rf-Wert und ist Ninhydrin-positiv wofür nach dem Lehrbuch Norephedrin und Norpseudoephedrin (Phenylpopranolamin und Cathin) in Frage kommen, nicht jedoch Ephedrin, das unterhalb des Omeprazols laufen müsste. Pseudoephedrin wird im Buch nicht aufgeführt. Ich habe daher wieder eine DC zur Identitätsprüfung wie oben durchgeführt. Laufmittel (speziell für Ephedraalkaloide) ist Methanol + Ammoniak 25% (10 + 0,15)[6].

Identifzierung Ephedraalkaloide 3x.jpg
Identifzierung Ephedraalkaloide 3x.jpg (17.12 KiB) 180 mal betrachtet
Abb. DC der Fraktion III nach dem TAV-Schema (Detektion: Ninhydrin)
v.l.n.r. Phenylpropanolamin – Phenylpropanolamin + Fraktion III – Pseudoephedrin – Pseudoephedrin + III – Cathin – Cathin + III

Die Substanz wird als Pseudoephedrin identifiziert. Da ich es nicht in Substanz gewonnen hatte, konnte ich keine Identifizierungsreaktion durchführen.
Die beiden Inhaltsstoffe von Boxagrippal sind damit getrennt und identifiziert worden.


Entsorgung:

Ether und Dichlormethan aus den Fraktionen IA bis II werden recycelt. Die Lösungsmittelgemische III und IV werden mit den halogenhaltigen organischen Abfällen entsorgt. Die methanolischen DC-Lösungen sowie die DC-Fließmittelreste kommen zum halogenfreien organischen Abfall.


Erklärungen:

Im Laufe der Analyse von Boxagrippal fanden sich zunächst zwei Stoffe mit differierenden Eigenschaften: einer in der Fraktion I bei dem es sich um eine Substanz mit sauren Eigenschaften (oder einen Neutralstoff) handeln musste. Basen können nicht anwesend sein, da I aus stark saurem Medium (pH 1) ausgeschüttelt wird. Umgekehrt musste es sich bei der in III enthaltenen Substanz, die aus stark alkalischer Lösung extrahiert wurde (pH >10) um eine organische Base handeln. Die Stoffe wurden dann als Ibuprofen und Pseudoephedrin identifiziert.
Formeln Ibu und Pseudoephedrin.jpg
Ibuprofen ist ein klassischer Vertreter der als nicht-steroidale Antiphlogistika bzw. Antirheumatika (NSAR) bekannten Arzneistoffe, von denen als erster Vertreter zum Ende des 19. Jahrhunderts die Acetylsalicylsäure - das AspirinR - auf den Markt kam. NSAR wirken hemmend auf Entzündungsprozesse, senken Fieber und lindern Schmerzen indem sie das Enzym Cyclooxygenase hemmen. Die Cyclooxygenase ist für die Synthese einer Gruppe von Botenstoffen, der sogen. Prostaglandine verantwortlich, die im Körper u.a. im Rahmen von Entzündungsprozessen gebildet werden und eine Verstellung der Temperatur-Sollwertes im Hirnstamm bewirken, was zur Erhöhung der Körpertemperatur führt. Ibuprofen wirkt ab einer Dosis von 200 mg schmerzstillend und fiebersenkend, wobei die Wirkung etwa 8 Stunden anhält. Für eine klinisch relevant entzündungshemmende Wirkung sind höhere Dosen notwendig. Die Höchstdosis beträgt 2400 mg/Tag.

Pseudoephedrin gehört in die Gruppe der Phenylpropanolamine und ist pharmakologisch betrachtet ein sogenanntes indirektes Sympathomimetikum. Es bewirkt in Dosen von 30-60 mg 3x täglich eine milde Stimulation eine Abschwellung der Schleimhäute und die Linderung von Bronchospasmen indem es die Wiederaufnahme der in die Synapsen des sympathischen Nervensystems ausgeschütteten Neurotransmitter Adrenalin und Noradrenalin (mit denen es eine strukturelle Verwandtschaft aufweist!) hemmt. Die Weckwirkung und Kreislaufwirkung (Blutdruckerhöhung, Tachycardie) soll geringer sein, als die des stereoisomeren Ephedrins. Aber die Wirksamkeit auf Erkältungssymptome über die stimulierende Wirkung hinaus ist schon seit einiger Zeit in Frage gestellt worden. Die meisten Mischpräparate in diesem Anwendungsgebiet enthalten Coffein, das zusätzlich die Wirkung von Schmerzmitteln synergistisch verstärkt. Eine Tablette Paracetamol oder Ibuprofen und eine Tasse schwarzer Tee sind preiswerter und tun die gleichen Dienste.

Im Gegensatz zur anorganischen Analyse, wo die Anzahl möglicher aufzufindender Elemente überschaubar ist und z.B. für die Kationen ein allgemeingültiger Analysengang existiert, gibt es für die Identifizierung eines unbekannten organischen Pharmakons keinen einheitlichen Weg.
Für die Extraktion von Pharmaka aus der Arzneimittelmatrix kommen verschiedene Lösungsmittel in Frage. Methanol und Ethanol sowie Aceton sind am gängigsten und am häufigsten erfolgreich, für sehr lipophile Substanzen eventuell auch Dichlormethan oder Petrolether. Sehr oft ist es vorteilhaft, das Analysengut mit einer ethanolischen Lösung von Weinsäure (0,2-0,5 g) zu mazerieren und dann im Soxhlet mit Ethanol zu extrahieren. Die Weinsäure setzt organische Säuren, die gut ethanollöslich sind, aus ihren Salzen frei und führt Alkaloide und andere basische Stoffe in die, im allgemeinen ebenfalls in Ethanol löslichen, Tartrate über. Auch das Ausziehen in angesäuertem oder alkalisiertem Wasser kann sinnvoll sein, sofern störende Begleitstoffe (vor allem Quellstoffe wie Stärke und deren Modifikationen, lösliche Cellulosederivate, Povidon etc.) abwesend sind. Über die Löslichkeit des Arzneistoffes und die der Begleit- und Hilfsstoffe (die möglichst gering ausfallen sollte) in dem jeweiligen Löungsmittel findet man Angaben in der Literatur[1],[3], oder im Arzneibuch. Wenn gar keine Anhaltspunkte über das Lösungsverhalten einer noch unbekannten Substanz vorliegen, wird man verschiedene Lösungsmittel ausprobieren und die Extraktionsausbeute bestimmen müssen.

Der Weg zur Identifizierung der extrahierten Substanz(en) folgt dann einer Art “Trichter-Technik“: die möglichen Kandidaten werden zunächst durch das Extraktionsverfahren und den Trennungsgang einer Gruppe mit bestimmten chemischen Eigenschaften zugeordnet und dann die Zahl der Möglichkeiten durch aufeinanderfolgende DCs immer weiter eingeengt, bis man nur noch zwischen wenigen Alternativen zu entscheiden hat. Das hier angewandte Verfahren des Lehrbuches[1] ist nur eine Variante, die zudem auf das universitäre Praktikum in pharmazeutischer Analytik zugeschnitten ist. In der Literatur sind vor allem für toxikologische Anwendungen weitere Wege beschrieben[2],[3],[4], denen ein gemeinsames Prinzip zugrunde liegt: immer werden verschiedene DC-Systeme angewandt, in denen die in Frage kommenden Stoffe möglichst unterschiedliche Laufeigenschaften besitzen sollten (man sagt, der Korrelationskoeffizient zwischen den Systemen muss möglichst niedrig sein) und aus der Kombination der Daten werden dann die in Betracht kommenden Substanzen emittelt. Es ist viel Arbeit darauf verwendet worden, die Analysenbedingungen in der DC so zu standardisieren, dass reproduzierbare Rf-Werte erhalten werden, und es existieren ausführliche Tabellenwerke zu den Rf-Werten zahlreicher Pharmaka in mehreren verschiedenen chromatographischen Systemen[2],[3]. Leider ist die Reproduzierbarkeit dennoch oft nicht so gut, dass man die Substanz allein über ihren Rf-Wert identifizieren könnte, selbst wenn dieser anhand der Referenzsubstanzen korrigiert wird. Wo immer möglich wird man daher versuchen, weitere Identifizierungsreaktionen durchzuführen, die man im Arzneibuch oder in den Lehrbüchern[1],[3] findet (immer parallel mit einer authentischen Probe der vermuteten Substanz) und so einen “Indizienbeweis“ aufbauen (in die Monographie der TIAFT ist die systematischen Anwendung von Sprühreagenzien aufgenommen worden[2]). Auch der einfache Lassaigne -Aufschluss kann bei der Zuordnung weiterhelfen - und natürlich die Bestimmung des Schmelzpunktes als wichtigstem physikalischem Parameter. Dazu ist es aber notwendig, die Substanz in ausreichender Menge und Reinheit zu isolieren, wofür man sie ggf. im Mikromaßstab umkristallisieren muss (was ich mit dem von mir isolierten Ibuprofen nicht machen konnte, da es zu wenig war).

Letztlich hat jede pharmakologisch-toxikologische Analyse Züge eines detektivischen Vorgehens: Man wird Zusatzinformationen heranziehen um den Kreis der “Verdächtigen“ abzustecken. In einem pflanzlichen Potenzmittel aus Ostasien wird man nach Sildenafil und anderen PDE-5-Hemmern fahnden, in einem Rheumamittel nach NSAR oder Corticosteroiden. Oder – um ein aktuelles Beispiel aus dem letzten Jahr aufzugreifen – wenn ein russischer Oppositioneller plötzlich schwer mit den Symptomen eines cholinergen Syndroms erkrankt, wird man nach einem Giftstoff aus der Gruppe der Cholinesterasehemmstoffe[7] (bei anderer Symptomatik z.B. nach einem Radiopharmakon) suchen. Zu einer erfolgreichen Analyse gehören neben breiter Kenntnis der Materie auch Kombinationsgabe, Intuition - und wohl auch ein gewisses Quantum Glück.


Literatur:

[1] Karl-Arthur Kovar und Claus O.L. Ruf: Auterhoff-Kovar – Identifizierung von Arzneistoffen; 6. völlig neu bearbeitete Auflage 1998, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart; ISBN 3-8047-1554-0
[2] DFG/TIAFT: Thin-layer Chromatografic Rf-Values of Toxicologically Relevant Substances on Standardized Systems; 2nd revised and enlarged edition 1992; VCH Verlagsges. mbH Weinheim / VCH Publishers Inc. New York; ISBN 3-527-27361-1 (Weinheim) bzw. 0-89573-665-9 (New York)
[3] Anthoy C Moffart, M Daivd Osselton, Brian Widdop, Jo Watts (ed.): Clarke‘s Analysis of Drugs and Poisons; 4th Edition 2011, Pharmaceutical Press London; ISBN 978-0-85369-711-4
[4] A. H. Stead, R. Gill, T. Wright, J. P. Gibbs and A. C. Moffat: Standardised Thin-layer Chromatographic Systems for the Identification of Drugs and Poisons; Analyst 107 (1982): 1106-1068
[5] L Komsta, M Waksmundzka-Hajnos, J Sherma (ed.): Thin Layer Chromatography in Drug Analysis; CRC Press, Taylor & Francis 2014; ISBN 978-1-4665-0716-6
[6] Jürgen Wolf: Mikro-Dünnschichtchromatographie; 4. Auflage 2015, Govi-Verlag Eschborn; ISBN 978-3-7741-1180-6
[7] Gregory R. Coittone: Toxidrome Recognition in Chemical-Weapons Attacks: N Engl J Med 378 (2018):1611-1620
"Alles sollte so einfach wie möglich gemacht werden. Aber nicht einfacher."(A. Einstein 1871-1955)

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Uranylacetat
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Re: Analyse von Pharmaka (II) - Identifizierung durch systematische Dünnschichtchromatographie

Beitrag von Uranylacetat »

Das ist ein interessanter Analyse-Klassiker mit historischen Kontext! :thumbsup: Da hast Du lieber lemmi wieder mit Herzblut experimentiert und dokumentiert!
"Der einfachste Versuch, den man selbst gemacht hat, ist besser als der schönste, den man nur sieht." (Michael Faraday 1791-1867)

Alles ist Chemie, sofern man es nur "probiret". (Johann Wolfgang von Goethe 1749-1832)

„Dosis sola facit venenum.“ (Theophrastus Bombastus von Hohenheim, genannt Paracelsus 1493-1541)

"Wenn man es nur versucht, so geht´s; das heißt mitunter, doch nicht stets." (Wilhelm Busch 1832 -1908)

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