Analyse von Anthocyanen in Pflanzen

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mgritsch
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Analyse von Anthocyanen in Pflanzen

Beitrag von mgritsch »

Analyse von Anthocyanen in Pflanzen

Anthocyane sind im Pflanzenreich eine fast universell verbreitete Stoffgruppe und für die meisten rot-lila bis blauen Färbungen verantwortlich. Ihr Grundkörper ist ein Flavylium-Kation, durch verschiedene Substituenten (meist Hydroxy- und Methoxy-Gruppen) ergibt sich das sogenannte Anthocyanidin. Dieses ist der Chromophor, liegt in der Pflanze aber nicht frei vor sondern glycosidisch gebunden an verschiedene Zucker - so ergibt sich eine große Vielfalt an Farbstoffen die für Pflanzen oft charakteristisch ist. Durch Analyse der genauen Verteilung mittels HPLC kann z.B. sogar bei Wein die Herkunft bzw. Rebsorten-Zusammensetzung bestimmt werden[7].

Diese Tabelle gibt einen kleinen Überblick über die Vielfalt und Vorkommen[1, 2, 3]:
2020-06-03 17_19_50-Microsoft Excel - Vorkommen.xlsx.png
Die meisten Angaben zu DC in der Literatur beziehen sich auf Papierchromatographie[3], Versuche mit Cellulose-DC-Platten waren aber wenig erfolgreich. Es konnte zwar eine gute Trennung erreicht werden, die Spots waren jedoch so verwaschen dass die Identifikation schwer fällt. Weiters sind die Laufzeiten in diesem Medium sehr hoch (2 Stunden und mehr) sodass es nicht sehr praktikabel ist. Ich konnte jedoch zwei Literaturstellen[4, 5] finden, in denen entsprechende HPTLC-Methode auf Kieselgel beschrieben sind - diese funktionieren grundsätzlich auch auf normalen Kieselgel-Platten sehr gut.

Geräte:
Reagenzgläser, Pipetten, Wasserbad, Uhrglasschalen, DC-Platten und DC-Kammer


Chemikalien:
Salzsäure
Ethylacetat
1-Pentanol
Ameisensäure
Toluol
Methanol
Butanon


Durchführung:
Zur Herstellung des Anthocyanidin-Extrakts werden einige Blütenblätter in einem Reagenzglas mit wenigen ml 2 molarer HCl für 45 Minuten am (fast) siedenden Wasserbad erhitzt. Gelegentlich kann mit einem Glasstab umgerührt werden, zerreiben ist jedoch nicht notwendig da die Blätter von der heißen HCl aufgeschlossen werden. Nachdem die Lösung ausgekühlt ist, wird durch ein kleines Stück Watte in ein Reagenzglas filtriert.

Zuerst wird der Extrakt zwei Mal mit wenigen ml Ethylacetat ausgeschüttelt (zur Entfernung von anderen farbigen Stoffen wie zB Flavonoiden) und nach abpipettieren im heißen Wasserbad restliches Ethylacetat vertrieben. Nun wird mit wenigen ml 1-Pentanol ausgeschüttelt, dabei geht der Großteil der Anthocyanidine in die organische Phase über. Die organische Phase wird mit einer Pasteur-Pipette vorsichtig entnommen und auf einer Uhrglasschale am Wasserbad auf ca 1/3 eingeengt. Das so erhaltene Konzentrat kann direkt zur DC benutzt werden.

Nach gleicher Methode wurden ebenfalls Extrakte bzw. Konzentrate von Rotwein ("Zinfandel"; 10 ml Rotwein + 2 ml konz. HCl), Heidelbeeren und Auberginenschale hergestellt.

Laufmittel für DC (Kieselgel 60): Ethylacetat - Toluol - Ameisensäure - Wasser 10:3:1,2:0,8
Die Rezeptur ist für ein gutes Trennergebnis genau einzuhalten.
Zum Auftrag wurden Kapillaren 0,3 mm Innendurchmesser benutzt und möglichst schmale Streifen gespottet. 1-Pentanol zerfließt auf Kieselgel nur sehr wenig, das unterstützt einen konzentrierten Auftrag. Allerdings muß es vor Entwicklung gründlich abgefönt werden!

Die Anthocyanidine liegen recht schmal beieinander aber sind noch klar getrennt, die Rf-Werte reichen von 0,20 - 0,33, Details siehe Bilder. Wenn die Ameisensäure aus dem Laufmittel langsam abdampft, treten die Farbunterschiede noch deutlicher hervor was für die Identifikation hilfreich ist. Allzu lange darf man jedoch nicht zuwarten, die Farbstoffe sind labil und nach einem Tag fast vollständig verblasst.

Zur Herstellung des Anthocyan-Extrakts wurden einige Blütenblätter mit einer geringen Menge (ca 1 ml) an methanolischer HCl (ca. 1% konz. HCl in Methanol) ungefähr 10 Minuten bei Raumtemperatur im Reagenzglas mit dem Glasstab verrieben. Die Lösung wurde ebenfalls durch ein kleines Stück Watte in ein Reagenzglas filtriert und im Vakuum-Exsiccator auf ca. die Hälfte des Volumens eingeengt. Erwärmen sollte hier unterbleiben um die Glycoside nicht zu spalten. Das so erhaltene Konzentrat kann direkt zur DC benutzt werden.

Laufmittel für DC (Kieselgel 60): Ethylacetat - Ameisensäure - Wasser 14:3:3
Die Rezeptur ist für ein gutes Trennergebnis genau einzuhalten.
Zum Auftrag wurden Kapillaren 0,3 mm Innendurchmesser benutzt und möglichst schmale Streifen gespottet. Wegen des HCl-Gehalts des Extrakts muß vor Entwicklung gründlich abgefönt werden!

Die Aglycone laufen damit im Bereich >0,8 und sind eher schlecht getrennt, Monoglucoside und Acetylierte Anthocyane sind in etwa im Bereich 0,3 - 0,5, Diglucoside oder Triglucoside darunter. Diese Informationen sind nur ein grober Trend und Anhaltswert, genaue Literaturangaben dazu sind sehr schwer zu finden. Auch zur mengenmäßigen Verteilung der Anthocyane gibt es kaum klare Angaben, selbst in der Struktur widersprechen sich die Literaturstellen teilweise und natürlich ist die Verteilung auch sorten- und regionsspezifisch. Eine Interpretation ist daher nur teilweise möglich bzw. nur wenn eindeutige Referenzsubstanzen vorliegen. Wenn die Ameisensäure aus dem Laufmittel langsam abdampft, treten die Farbunterschiede noch deutlicher hervor was für die Identifikation hilfreich ist - grundsätzlich bleibt der Farbton des Chromophors auch in den Glykosiden erhalten. Die Farbstoffe sind deutlich stabiler als die Aglykone und nach einem Tag noch gut erkennbar. Durch Bedampfen mit Ammoniak kann eine weitere Farb-Differenzierung erzielt werden, dann sollte aber sehr rasch fotografisch dokumentiert werden da die Farben danach binnen weniger Minuten verblassen.

Wen man die Polarität des Laufmittels erhöht (Ethylacetat - Ameisensäure - Wasser 16:5:5) dann steigen die Rf-Werte der Anthocyane, die Auftrennung wird aber nicht wesentlich besser, teils sogar schlechter. Erstaunlich war lediglich, dass beim Mohn-Extrakt auf einmal ein weiterer Spot mit niedrigem Rf erkennbar wurde der der Farbe nach dem Cyanidin zuzuordnen sein sollte.


Entsorgung:
Die Lösungen können nach Neutralisation zum Abwasser gegeben werden, Laufmittel kommt zu den halogenfreien Abfällen.


Erklärung:
Durch Erhitzen mit verdünnter Salzsäure kann aus dem Anthocyan der Anthocyanidin-Grundkörper (das sogenannte Aglykon) leicht hydrolysiert und gelöst werden, dieses kann dann mittels DC analysiert werden. Extrahiert man mit methanolischer HCl, so erhält man die unzersetzten Anthocyane.


Bilder:
IMG_5636.JPG
Das unschuldige Opfer für die Wissenschaft


IMG_5704.JPG
Auch die Aubergine enthält reichlich Anthocyane in der Schale!


IMG_5637.JPG
Beginnende Extraktion der Blütenblätter mit HCl


IMG_5638.JPG
Filtration des Extrakts - sehr intensiv gefärbt


IMG_5639.JPG
Ausschütteln mit Ethylacetat


IMG_5640.JPG
Ausschütteln mit 1-Pentanol


IMG_5641.JPG
Aufkonzentrieren des 1-Pentanol Extrakts


IMG_5644.JPG
Die Farbstoffe der Rose haben ausgeprägte pH-Indikator-Eigenschaften, mit wenig Ammoniak ergibt sich eine tiefblaue Färbung die jedoch nach kurzer Zeit verblasst. Die meisten anderen Farbstoffe ergeben im alkalischen eine grüne bis lilafarbene Färbung.


IMG_5657.JPG
Eine möglichst schmale Linie aufzutragen ist wichtig für eine erfolgreiche Trennung


IMG_5741ed.JPG
DC ist am Laufen...


IMG_5679.JPG
Direkt nach der Entwicklung; v.l.n.r. Rose, Rotwein, Heidelbeere


IMG_5682.JPG
unter UV254nm kann man noch einige andere Banden erkennen v.l.n.r. Rose, Rotwein, Heidelbeere


IMG_5695.JPG
wenn die Säure aus dem Laufmittel langsam abdampft, treten die Farbunterschiede noch deutlicher hervor was für die Identifikation hilfreich ist. Allzu lange darf man jedoch nicht zuwarten, die Farbstoffe sind labil und nach einem Tag fast vollständig verblasst. (v.l.n.r. Rose, Rotwein, Heidelbeere)


2020-06-02 16_19_30-Präsentation1.pptx - Microsoft PowerPoint.png
Besonders im "Durchlicht" sind die Farben sehr prächtig zu erkennen - anhand der Literaturwerte[4] (die kleine eingeblendete Legende, das dort fehlende Petunidin wurde ergänzt) konnten sie eindeutig zugeordnet werden! (v.l.n.r. Rose, Rotwein, Heidelbeere)


IMG_5729.JPG
Links wieder Rose und Rotwein als "Referenz", rechts der Extrakt aus Aubergine. Nur Delphinidin ist darin nachweisbar!


2020-06-07 20_26_06-Präsentation2.pptx - Microsoft PowerPoint.png
DC der Anthocyane im "Durchlicht", (v.l.n.r. Rose, Aubergine, Klatschmohn; die Skala sind Rf-Werte)
Versuch einer Interpretation mit Hilfe der Literatur[4,5,6]:
1 = Cyanidin 3,5 Diglucosid
2 = Pelargonidin 3,5 Diglucosid
3 = Cyanidin 5 Glucosid
4 = Pelargonidin - 5 Glucosid
5 = Delphinidin - ?
6 = Delphinidin 3,5 Diglucosid
7 = Delphinidin 3 p-Coumaroylrutinosid-5-glucosid (Nasunin)
8 = Pelargonidin 3 Rutinosid-5-glucosid
9 = Cyanidin - 3-Cellobiosid
10 = Pelargonidin 3-Cellobiosid
11 = Cyanidin 3-Glucosid
12 = Pelargonidin 3-Glucosid


2020-06-08 16_30_06-Präsentation2.pptx - Microsoft PowerPoint.png
DC mit polarerem Laufmittel (Ethylacetat - Ameisensäure - Wasser 16:5:5)
Links - Durchlicht; Mitte - UV365nm; rechts - Durchlicht nach Bedampfung mit NH3
(jeweils v.l.n.r. Rose, Aubergine, Klatschmohn; die Skala sind Rf-Werte)


Literatur:
[1] KONSTITUTION UND VORKOMMEN DER ORGANISCHEN PFLANZENSTOFFE (EXCLUSIVE ALKALOIDE); ISBN 978-3-0348-5143-5
[2] HANDBUCH DER LEBENSMITTELCHEMIE - ERSTER BAND - DIE BESTANDTEILE DER LEBENSMITTEL; ISBN 978-3-642-46012-8
[3] Phytochemical Methods A GUIDE TO MODERN TECHNIQUES OF PLANT ANALYSIS; ISBN-13: 978-94-010-8956-2
[4] Journal of Chromatography A, 1289 (2013) p.105– 118
[5] Chromatographia 11, (1978), p.193–196
[6] Anthocyanins and their Sugar Components. By J. B. HARBORNE, in: L. Zechmeister (ed.), Fortschritte der Chemie Organischer Naturstoffe; Vol. 20, Springer-Verlag Vienna 1962; ISBN 978-3-7091-7155-4
[7] Mitteilungen Klosterneuburg 52, (2002), p.187-194

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mgritsch
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Re: Analyse von Anthocyanen in Pflanzen

Beitrag von mgritsch »

Und somit auch der erste Artikel über den neuen Editor, funktioniert :)
Die Alten Chemtags werden noch verschwinden.

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NI2
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Re: Analyse von Anthocyanen in Pflanzen

Beitrag von NI2 »

Und achte mal auf die Schriftgröße im Titel ;)
I OC

There is no sadder sight in the world than to see a beautiful theory killed by a brutal fact. [T. Huxley]
The pursuit of knowledge is hopeless and eternal. Hooray! [Prof. H. J. Farnsworth]

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mgritsch
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Re: Analyse von Anthocyanen in Pflanzen

Beitrag von mgritsch »

Ich sehe nichts ungewöhnliches?
Edit : oh, ha, weil es so klein ist dass man es schon nicht mehr sieht ;)

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lemmi
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Re: Analyse von Anthocyanen in Pflanzen

Beitrag von lemmi »

Hübsch! Die Trennung hat ja bilderbuchmäßig funktioniert, und so schön bunt! :D

Was ich noch nicht verstehe ist die Literatur-Referenz. Da sind 5 Spots zu sehen und daneben stehen 6 Bezeichnungen - was gehört wozu? Hast du das aus einer Monografie oder ist das eine selbst gemachte Referenz? Und welche Anthocyanidine hast du jetzt in Rose, Rotwein und Heidelbeere identifiziert?
"Alles sollte so einfach wie möglich gemacht werden. Aber nicht einfacher."(A. Einstein 1871-1955)

"Wer nur Chemie versteht, versteht auch die nicht recht!" (G.C. Lichtenberg, 1742 - 1799)

"Die gefährlichste Weltanschauung ist die Weltanschauung der Leute, die die Welt nie gesehen haben." (Alexander v. Humboldt, 1769 - 1859)

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mgritsch
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Re: Analyse von Anthocyanen in Pflanzen

Beitrag von mgritsch »

lemmi hat geschrieben:
Donnerstag 4. Juni 2020, 22:55
Was ich noch nicht verstehe ist die Literatur-Referenz. Da sind 5 Spots zu sehen und daneben stehen 6 Bezeichnungen - was gehört wozu? Hast du das aus einer Monografie oder ist das eine selbst gemachte Referenz? Und welche Anthocyanidine hast du jetzt in Rose, Rotwein und Heidelbeere identifiziert?
Die Literaturreferenz ist die Publikation gemäß Fußnote und ist das kleine eingeblendete Bild. Den Text habe ich selbst ergänzt damit man sich nicht durch die Zahlen suchen muss (fand ich mühsam...) Die Referenz enthielt allerdings kein Petunidin, das habe ich ergänzt - zumindest in den Heidelbeeren ist es erkenbar, da sind eindeutig 2 lila Spots unter dem roten Malvidin. Von der Chemie her und von anderen Publikationen kann es nur dort auftauchen.

Naheliegenderweise stehen die Bezeichnungen auf der jeweiligen Höhe der Spots, ich habe es dem Betrachter überlassen zu erkennen dass zB die Rose Pelargonidin und Cyanidin enthält oder der Rotwein noch ein klein wenig Paeonidin und Cyanidin.. dachte das ist anhand der „Legende“ recht offensichtlich? :angel:

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lemmi
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Re: Analyse von Anthocyanen in Pflanzen

Beitrag von lemmi »

Hmm, also wenn das ganz links (Rose) Pelargonidin und Cyanidin sind, enthält der Rotwein aber kaum Cyanidin sondern vorherrschend Malvidin: läuft weiter unten und hat eine andere Farbe. Oder habe ich da deinen letzten Post falsch verstanden ("ein klein wenig Cyanidin")
Bild
Und in der Heidelbeere wären dann Malvidin und Delphinidin vorherrschend neben wenig Cyanidin und Petunidin. Oder?
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mgritsch
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Re: Analyse von Anthocyanen in Pflanzen

Beitrag von mgritsch »

lemmi hat geschrieben:
Freitag 5. Juni 2020, 23:20
Hmm, also wenn das ganz links (Rose) Pelargonidin und Cyanidin sind, enthält der Rotwein aber kaum Cyanidin sondern vorherrschend Malvidin: läuft weiter unten und hat eine andere Farbe. Oder habe ich da deinen letzten Post falsch verstanden ("ein klein wenig Cyanidin")
Und in der Heidelbeere wären dann Malvidin und Delphinidin vorherrschend neben wenig Cyanidin und Petunidin. Oder?
ja genau so. "ein klein wenig Cyanidin" war nicht präzise, bezog sich auf zusätzlich zum offensichtlichen Malvidin.
Ich habe jetzt auch noch ein besseres Laufmittel für die Anthocyane gefunden, macht richtig Spaß damit, im Artikel angepasst. Die Interpretation verursacht allerdings Kopfschmerzen :)

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