Extraktion von Amygdalin aus bitteren Mandeln

Isolierung und Synthesen von Naturstoffen.

Moderator: Moderatoren

Antworten
Benutzeravatar
lemmi
IllumiNobel-Gewinner 2012
Beiträge: 5606
Registriert: Freitag 6. Januar 2012, 09:25

Extraktion von Amygdalin aus bitteren Mandeln

Beitrag von lemmi »

Amygdalin aus bitteren Mandeln

Amygdalin - der für den bitteren Geschmack und ihre Giftigkeit verantwortliche Inhaltsstoff der Bittermandeln - ist das bekannteste cyanogene Glykosid. Die Giftwirkung beruht darauf, dass es enzymatisch oder säurekatalysiert in Glukose, Benzaldehyd und Cyanwasserstoff zerfällt, wobei der typische “Bittermandelgeruch“ eher dem Benzaldehyd als der freiwerdenden Blausäure geschuldet ist.
Amygdalin war auch das erste cyanogene Glykosid, das rein dargestellt wurde (es wurde 1830 zum ersten Mal isoliert). Die Extraktion aus bitteren Mandeln ist relativ simpel, wenngleich zeitaufwändig. Die am weitesten verbreitete Vorschrift stammt von Stahl und Schild[1] und ist wörtlich auch im Internet, z.B. auf Lambdasyn nachzulesen. Etwas abweichende Angaben macht Hager[2]. Durch eine Kombination der Vorschriften lässt sich die Ausbeute gegenüber der Methode[1] deutlich verbessern und ein Präparat von hoher Reinheit darstellen.


Material/Geräte:
Magnetheizrührer mit Wasserbad, 250 und 500 ml-Rundkolben, 500 ml- Dreihalsrundkolben, Soxhlet-Extraktor 100 ml, Intensiv-RF-Kühler, Destillationsbrücke, Nutsche, Trichter mit Faltenfilter, Kleine Bechergläser, Kolben 100 ml, Waage; Reagenzgläser, Pipetten, Messzylinder, Scheidetrichter, Vorrichtungen für die DC (Folien Kieselgel G60 254F).


Chemikalien:
Wundbenzin (Petrolether) Warnhinweis: fWarnhinweis: xn
Ethanol 96% Warnhinweis: fWarnhinweis: attn
Diethylether Warnhinweis: fWarnhinweis: attn
bittere Mandeln Warnhinweis: xn
Amygdalin Warnhinweis: xn


Versuchsdurchführung:
Die Bitteren Mandeln werden zunächst für ½ Stunde im Backofen bei 100 °C erhitzt und nach dem Abkühlen mit einer Küchenreibe und dann in einer Kaffeemühle fein zerkleinert. Dabei entsteht eine fettige, teigartige Masse. Diese wird in die Hülse eines Soxhlet-Extraktors überführt und für ca. 8 Stunden mit Wundbenzin extrahiert. Bei meinem Versuch fasste eine Hülse 35 g der geriebenen Mandeln. Nach 4 Stunden hinterließ das ablaufende Extraktionsmittel beim Verdunstenlassen auf einem Uhrglas noch einen Fettfilm, so dass die Extraktion weitere 4 Stunden fortgesetzt wurde. Die entfettete Droge wird dann auf einem Teller ausgebreitet und die Reste des Lösungsmittels an der freien Luft (Abzug oder im Freien) verdunsten gelassen. Aus 35 g Mandeln erhielt ich 20 g entfettetes Mandelpulver. Um die Extraktion lohnender zu gestalten wurde die Prozedur mit einer weiteren Portion Bittermandeln wiederholt.

35 Gramm der entfetteten, gemahlenen Bittermandeln werden im Rundkloben mit 250 ml Ethanol 96% übergossen und im Wasserbad unter Rückflusskühlung für 2 Stunden gekocht. Die Mischung wird heiß über eine Nutsche abgesaugt (Vorsicht, das Filtrat kann unter vermindertem Druck aufsieden und schäumen!), und der Rückstand nochmals mit 200 ml Ethanol für 2 Stunden refluxiert. Nach erneutem Absaugen wird der Rückstand mit 50 ml Ethanol nachgewaschen. Die vereinigten, goldgelb gefärbten und leicht trüben Auszüge bleiben über Nacht stehen und werden dann durch ein einfaches Faltenfilter filtriert, durch das der Extrakt ganz klar abläuft.
Als nächstes wird der Extrakt destillativ eingeengt. In Ermangelung eines Rotationsverdampfers kann dazu ein Dreihalskolben mit Magnetrührer verwendet werden, an den ein einfacher Gegenstromkühler mit Vorlage angeschlossen und der mit einem Rührfisch versehen im fast siedenden Wasserbad erhitzt wird. Zunächst werden ca. 50 ml Extrakt in den Kolben gegeben und aus einem Tropftrichter immer so viel nachfließen gelassen, als Ethanol in die Vorlage abdestilliert. Die Flüssigkeit wird so auf etwas mehr als 10 ml eingeengt, was 2 Stunden in Anspruch nimmt.

Zu dem eingeengten Extrakt, der etwas dickflüssig und leicht trübe ist, werden dann unter Rühren 5 ml Diethylether hinzugefügt. Dabei entsteht ein klebriger, gelbbrauner Klumpen, den man mit einem Spatel zerteilt. Nach Zugabe von weiteren 20 ml eines Gemisches aus Ethanol und Ether (6 vT + 4 VT) und längerem Rühren bildet sich eine Suspension (es erscheint hier sinnvoll, von vorneherein mit größeren Volumina zu arbeiten, indem man z.B. nur auf ca. 30 ml eindampft und dann das Rohamygdalin mit 15 ml Ether fällt). Das Absaugen über eine Glassinternutsche ist problematisch, da dieselbe sehr rasch verstopft (ist mit Wasser leicht zu reinigen). Dagegen macht das Absaugen über einen Büchnertrichter mit Filterpapier keine Probleme. Das Rohprodukt wird mit etwas Ether gewaschen und an der Luft getrocknet. Erhalten wurden (aus 35 g entfetteten Mandeln - entsprechend 61,25 g frischen Mandeln) 5,0 g.

Stahl und Schild[1] empfehlen, das Roh-Amygdalin aus 96%igem Ethanol (2 g in 50 ml) umzukristallisieren und geben eine Ausbeute von 70% an, wobei nach DC-Prüfung eine zweite UK erforderlich wird, nach der schließlich 35% vom Rohprodukt verbleiben. Dies wurde mit 250 mg des Rohproduktes im Reagenzglas getestet (die Löslichkeit in siedendem Ethanol ist so gut, dass nur 2,5 ml verwendet wurden). Erhalten wurde 160 mg Produkt, das aber in der DC noch erhebliche Mengen einer Verunreinigung (Gentobiose) enthielt. Außerdem fiel auf, dass ein Teil nicht kristallin, sondern klebrig ausgefallen war - beim Kratzen mit dem Spatel blieb er an diesem hängen. Dieser Teil zeigte chromatographisch einen hohen Gehalt an Gentobiose (siehe unten).
Daher wird das Rohprodukt (Rest hier: 4750 mg) besser nach der Empfehlung von Hager[2] in 50 ml Ethanol 90% (V/V), unter Erhitzen im Wasserbad bis zum Sieden und Absaugen über eine vorgewärmte Nutsche, umkristallisiert. Nach Stehenlassen im Kühlschrank wird gut abgesaugt, mit 2 x 10 ml Ether nachgewaschen und getrocknet. Dieses Präparat erwies sich DC-analytisch als rein.

Ausbeute: 2,7 g feines weißes Pulver

Vor längerer Zeit hatte ich den Amygdalingehalt der von mir verwendeten Bittermandeln zu 5,3 % bestimmt. Berechnet man die Ausbeute an Endprodukt bezogen auf das Drogenmaterial so erhält man einen Wert von immerhin 83 % (da das Präparat kristallwasserhaltig ist, ist die Ausbeute in Wirklichkeit etwas geringer).


Analyse mittels DC
Als “Glykosid-Laufmittel“ dient die organische (obere) Phase einer Verschüttelung aus 8 ml 1-Butanol + 2 ml Eisessig + 10 ml Wasser. Die Entwicklung dauert auf einer Laufstrecke von 10 cm fast 2 Stunden! Die Analysenlösungen enthalten je 5 mg/ml Substanz in 50%igem Ethanol gelöst, aufgetragen werden jeweils 2 µl. Nach gutem Trocknen wird die Folie mit Anisaldehyd-Reagenz (0,5 ml Anisaldehyd mit 10 ml Eisessig und 85 ml Methanol mischen und vorsichtig 5 ml Schwefelsäure zugeben) besprüht und im Trockenschrank für 5-10 Minuten auf 100°C erhitzt, bis eine optimale Farbentwicklung erreicht ist.
Amygdalin färbt sich grün und findet sich im mittleren Rf-Bereich (ca. 0,4), darunter ergeben sich die Spots von Glucose (grün – ca. 0,25) und Gentobiose (blau-grün - ca. 0,15).


Spaltung des Glykosids
30 mg Amygdalin werden in 2 ml Schwefelsäure 2 N (ca. 10%ig) gelöst und im siedenden Wasserbad für 10 Minuten erhitzt. Ein in den Dampfraum gehängtes, mit Natriumcarbonatlösung befeuchtetes Pikrinsäurepapier verfärbt sich durch den gebildeten Cyanwasserstoff rot (Isopurpursäurereaktion).
Nach dem Abkühlen wird die Flüssigkeit durch Zugabe von 350 mg festem Natriumhydrogencarbonat neutralisiert und dann dreimal mit 2 ml Diethylether ausgeschüttelt. Die abpipettierten Etherfraktionen werden kurz mit etwas wasserfreiem Natriumsulfat geschüttelt und dann in ein weites Reagenzglas abgegossen. In heißem Wasser wird der Ether abgedampft (im Abzug oder am offenen Fester - Achtung, keine offenen Flammen in der Nähe!) und in das Reagenzglas 0,2 ml Ethanol gegeben. Von dieser Lösung und einer Vergleichslösung aus 2 µl Benzaldehyd in 1 ml Ethanol werden je 3 µl auf eine DC-Folie aufgetragen und bei Kammersättigung mit Dichlormethan als Laufmittel entwickelt (8 cm in ca. 10 Minuten). Der Nachweis des gebildeten Benzaldehyds erfolgte durch Fluoreszenzlöschung unter Betrachtung im UV-254 nm.
Vom wässrigen Rückstand wird 1 ml mit 2 ml Benedikts Reagenz versetzt und aufgekocht. Die Verfärbung nach Gelbgrün und ein beim Stehenlassen sich absetzender, roter Niederschlag zeigen das Vorliegen eines reduzierenden Zuckers (Glucose) an.


Entsorgung:
Die verwendeten Lösungsmittel werden durch Destillation recycelt oder den organischen, halogenfreien Lösungsmittelabfällen zugeführt. Das Produkt kann mit dem Hausmüll entsorgt werden.


Erklärungen:
Amygdalin leitet sich biogenetisch von der Aminosäure Phenylalanin (I) ab. Diese wird zunächst über eine Monoaminoxydase zu einer N-Hydroxy-aminosäure (II) oxidiert, welche durch oxydative Decarboxylierung in ein Aldoxim (III) umgewandelt wird. Unter Einwirkung der Aldoximdehydrase entsteht Phenylacetonitril (IV), das durch eine Monooxygenase in das korrespondierende alpha-Hydroxynitril (Mandelsäurenitril, V) übergeführt wird. Dieses stellt das Aglykon des Amygdalins dar. Durch Verknüpfung mit zwei Glukosemolekülen (das hierfür zuständige Enzym heißt Glucosyltransferase) wird schließlich das fertige Glykosid (VI) gebildet[3]. Interessanterweise ist die Biosynthese stereoselektiv: als Aglykon findet sich nur das linksdrehende Mandelsäurenitril (die R-Form)!

Bild

Bei der Spaltung des Amygdalins wird umgekehrt Glukose frei und das Mandelsäurenitril zerfällt in Benzaldehyd und Cyanwasserstoff. Die enzymatische Spaltung und die daraus resultierenden physiologischen Besonderheiten habe ich in diesem Artikel beschrieben.

Bild

Amygdalin (D(-)Mandelonitril-β-D-Gentobiosid) kristallisiert mit 3 Mol Kristallwasser, die beim Erhitzen auf 110-120 °C abgegeben werden. Es löst sich in 12 Teilen kaltem Wasser, sehr leicht in heißem Wasser sowie in 900 Teilen kaltem bzw. 11 Teilen siedendem Ethanol. In Ether ist es unlöslich.[2] Die spezifische Rotation bei 11°C wird mit -41° angegeben (c = 1,0 in Wasser), der Schmelzpunkt der wasserfreien Substanz mit 125-130°C[1].

Die Befunde zur ökologischen Bedeutung von cyanogenen Glykosiden sind komplex. Die Annahme, dass es sich bei den toxischen Verbindungen um einen Fraßschutz handelt, ist natürlich naheliegend. Andererseits gibt es Raupen, die in der Lage sind, die Glykoside unzersetzt zu speichern und ihrerseits als Fraßschutz gegen Feinde einzusetzen! Schließlich wurde gefunden, dass bestimmte Pflanzenenzyme Cyanwasserstoff zum Aufbau von Aminosäuren nutzen, so dass die cyanogenen Glykoside auch als Stickstoff-Depot dienen könnten. Insbesondere ihre hohe Konzentration in Samen könnte auch unter diesem Aspekt eine Erklärung finden.[3]



Bilder:
Bild
Die eingesetzten (ca. 30 Jahre alten) bitteren Mandeln.

Bild
Entfettung durch Extraktion mit Benzin im Soxhlet

Bild
Auskochen mit 96%igem Ethanol

Bild
Filtrieren des Extraktes

Bild
Einengen des Extraktes

Bild
Fällen des Rohproduktes durch Zugabe von Ether

Bild
Rohprodukt

Bild
Umkristallisation aus 90%igem Ethanol

Bild
umkristallisiertes Produkt

Bild
Dünnschichtchromatogramm nach UK aus 90%igem Ethanol (v.l.n.r. Amygdalin-Referenz – umkristallisiertes Produkt – Rohprodukt – Mutterlauge – Glukose)

Bild
Dünnschichtchromatogramm nach UK aus 96%igem Ethanol (v.l.n.r. Rohprodukt - umkristallisiertes Produkt – Amygdalin-Referenz – Glukose - klebriger Anteil des umkristallisierten Produktes)

Bild
HCN-Nachweis nach hydrolytischer Spaltung des Amygdalins

Bild
DC-Nachweis des gebildeten Benzaldehyds (links: Untersuchungslösung, rechts: Referenz)


Literatur:
[1] Stahl, Egon und Schild, Werner: Pharmazeutische Biologie 4 - Drogenanalyse und Inhaltsstoffe; Gustav fischer-Verlag Stuttgart New York 1981; ISBN 3-437-20209-X: 326-329
[2] Frerichs G, Arends G, Zörnig H: Hager´s Handbuch der Pharmazeutsichen Praxis; 2. berichtigter Neudruck 1949, Springer-Verlag Berlin-Göttingen-Heidelberg, Erster Band: 413
[3] Dingermann T, Hiller K, Schneider G, Zündorf I: Schneider – Arzneidrogen; 5. Auflage Spektrum Akademischer Verlag 2004; ISBN 978-3-82472765-6: 413-416
"Alles sollte so einfach wie möglich gemacht werden. Aber nicht einfacher." (A. Einstein 1871 - 1955)

"Wer nur Chemie versteht, versteht auch die nicht recht!" (G.C. Lichtenberg, 1742 - 1799)

"Die gefährlichste Weltanschauung ist die Weltanschauung der Leute, die die Welt nie gesehen haben." (Alexander v. Humboldt, 1769 - 1859)
Nail
Illumina-Mitglied
Beiträge: 260
Registriert: Mittwoch 2. Januar 2019, 21:45

Beitrag von Nail »

Ganz ordentlich! Ab und zu sind noch kleine formale Fehler drin.
Q.E.D.
Benutzeravatar
mgritsch
Illumina-Admin
Beiträge: 4349
Registriert: Montag 8. Mai 2017, 10:26
Wohnort: in den Misanthropen

Beitrag von mgritsch »

Schön :) endlich wieder ein echter lemmi :)
Naturstoffextraktion finde ich angesichts der Mischungen die in Pflanzen so vorkommen immer erstaunlich... dass da eine Reinsubstanz rauskommt?
Benutzeravatar
lemmi
IllumiNobel-Gewinner 2012
Beiträge: 5606
Registriert: Freitag 6. Januar 2012, 09:25

Beitrag von lemmi »

Danke! Das stand schon laaange auf meiner to-do-liste, so etwa seit 10 Jahren... 8)

Ich finde es immer etwas schwierig, wenn es nur eine einzige Literaturstelle/Vorschrift für etwas gibt. Hier ist die von Stahl/Schild die einzige allgemein bekannte (allerdings habe ich nicht sehr ausgiebig nach anderen gesucht) und das dort angegebenen UK aus 96%igem Ethanol ist wirklich nicht sehr effektiv. Was doch ein paar Prozent Wasser ausmachen!

Ich hoffe nur, die Formeln finden Gnade vor den Augen von NI2! (wahrscheinlich eher nicht...) :wink:
"Alles sollte so einfach wie möglich gemacht werden. Aber nicht einfacher." (A. Einstein 1871 - 1955)

"Wer nur Chemie versteht, versteht auch die nicht recht!" (G.C. Lichtenberg, 1742 - 1799)

"Die gefährlichste Weltanschauung ist die Weltanschauung der Leute, die die Welt nie gesehen haben." (Alexander v. Humboldt, 1769 - 1859)
Glaskocher
Illumina-Mitglied
Beiträge: 2522
Registriert: Dienstag 27. Oktober 2015, 22:17
Wohnort: Leverkusen

Beitrag von Glaskocher »

Amygdalin
CAS: 29883-15-6
Benutzeravatar
lemmi
IllumiNobel-Gewinner 2012
Beiträge: 5606
Registriert: Freitag 6. Januar 2012, 09:25

Beitrag von lemmi »

Ein Gramm zwischen 22 und 119 Euro ... :mrgreen:
"Alles sollte so einfach wie möglich gemacht werden. Aber nicht einfacher." (A. Einstein 1871 - 1955)

"Wer nur Chemie versteht, versteht auch die nicht recht!" (G.C. Lichtenberg, 1742 - 1799)

"Die gefährlichste Weltanschauung ist die Weltanschauung der Leute, die die Welt nie gesehen haben." (Alexander v. Humboldt, 1769 - 1859)
WaluligIQ
Illumina-Mitglied
Beiträge: 69
Registriert: Freitag 17. Januar 2020, 18:02

Beitrag von WaluligIQ »

Traumhaft seine Versuche nachzuverfolgen. Wie immer eins A :thumbsup:

welche Projekte kommen als nächstes?
Heliumoxid
Illumina-Mitglied
Beiträge: 201
Registriert: Dienstag 7. Januar 2014, 00:29

Beitrag von Heliumoxid »

Toll !
Bei Heliumoxid, genauer Helium(II)- oxid, handelt es sich um eine Mischung aus Helium(I)- oxid und Helium(III)- oxid. Richtigerweise heisst es somit Helium(I,III)- oxid.
Benutzeravatar
Visko
Illumina-Mitglied
Beiträge: 176
Registriert: Donnerstag 29. März 2018, 23:30

Beitrag von Visko »

Toller Artikel mit wundervollen Bildern! Aber sollte der Nitril-Kohlenstoff in Formel IV und V nicht sp-hybridisiert sein, also linear?
Es ist eine bedeutende und allgemein verbreitete Tatsache, dass Dinge nicht immer das sind, was sie zu sein scheinen.
Benutzeravatar
lemmi
IllumiNobel-Gewinner 2012
Beiträge: 5606
Registriert: Freitag 6. Januar 2012, 09:25

Beitrag von lemmi »

Doch, eigentlich schon! :oops:
Das kommt daher, dass ich die vorigen Formeln einfach kopiert und dann abgeändert habe. Ich bringe das nächstens in Ordnung
"Alles sollte so einfach wie möglich gemacht werden. Aber nicht einfacher." (A. Einstein 1871 - 1955)

"Wer nur Chemie versteht, versteht auch die nicht recht!" (G.C. Lichtenberg, 1742 - 1799)

"Die gefährlichste Weltanschauung ist die Weltanschauung der Leute, die die Welt nie gesehen haben." (Alexander v. Humboldt, 1769 - 1859)
Benutzeravatar
Pok
Gesperrt
Beiträge: 1636
Registriert: Montag 19. August 2013, 01:03
Kontaktdaten:

Beitrag von Pok »

Ist ja ne ganz schöne Menge, die man aus den Mandeln gewinnen kann. :) Hätte nicht gedacht, dass es so viel ist.
Receptar
Illumina-Mitglied
Beiträge: 46
Registriert: Sonntag 14. Oktober 2018, 15:56
Wohnort: Leipzig

Re: Extraktion von Amygdalin aus bitteren Mandeln

Beitrag von Receptar »

Synthesen sind alle ausführlich im Stahl beschrieben.....
Benutzeravatar
mgritsch
Illumina-Admin
Beiträge: 4349
Registriert: Montag 8. Mai 2017, 10:26
Wohnort: in den Misanthropen

Re: Extraktion von Amygdalin aus bitteren Mandeln

Beitrag von mgritsch »

edit: Korrekturgelesen und verschoben.
Antworten