Bestimmung des Eisengehalts in Ferritin

[guitar_player]

Liebes Forum,

in einem Universitätspraktikum sollten wir den Eisengehalt in Ferritinproteinen bestimmen. Leider stecke ich bei der Auswertung fest und bitte um Hilfe.

Im ersten Teil des Versuchs wurden Lösungen verschiedener Konzentrationen an Fe(II) mit Ferrozin zur Reaktion gebracht und die Absorption der Lösung bei λ_max des gebildeten Komplexes bestimmt. Auf diese Weise wurde eine Kalibrierfunktion erstellt, die die Abhängigkeit der Absorption von der Konzentration an Komplex/Fe(II) beschreibt.
Im zweiten Teil wurden 50 µL 0.5 mg/mL Ferritinlösung umgesetzt, wobei die Proteinhülle abgestreift und das Fe(III) zu Fe(II) reduziert wurde. Schließlich wurde die Konzentration an Fe(II) bestimmt.

Die Frage ist nun, wieviele Eisenatome in einem Ferritinprotein enthalten sind?

Durch die Kalibrierfunktion konnte ich auf die Anzahl freigesetzter Eisenatome rückschließen.
Weiters kenne ich M = 474000 g/mol von Apoferritin und M = 879.9 g/mol des Eisenkerns [FeO(OH)]₈[FeO(H₂PO₄)] im Protein. Da dieser Eisenkern durch je neun Eisenatome aufgebaut ist steigt die Molmasse des Eisenkerns um durchschnittlich 879.9/9 = 97.7 g/mol für jedes zusätzliche Eisenatom im Kern.
Um nun aber die Anzahl an Eisenatome pro Protein berechnen zu kennen brauche ich die Teilchenzahl an Proteine. Da die Ferritinkonzentration aber als Massenkonzentration gegeben ist bräuchte ich die Molmasse des mit Eisen beladenen Ferritinproteins. Hierfür bräuchte ich die Anzahl an Eisenatome.

Zirkelschluss oder Denkfehler? ^^

Ein Ansatz wäre gewesen, die Masse des Eisenkern gegenüber der Gesamtmasse des Proteins zu vernachlässigen. Bei einer Anzahl von mehreren tausend Eisenatomen (Quelle: https://de.wikipedia.org/wiki/Ferritin) wäre dieser Fehler aber zu groß. Habt ihr Ideen?

Vielen Dank!

[Glaskocher]

Zunächst muß man unterscheiden zwischen dem (unbeladenen) Apoferritin und dem beladenen Ferritin. So wie ich den Wikipedia-Artikel verstehe ist das Eisen als Mineralkorn im Inneren der Proteinhülle eingelagert, die es bei der Aufnahme oxidiert und damit besser ausfällbar macht. Bei Eisenmangel kann dieser Vorgang umfekehrt und das Eisen für andere Enzyme nutzbar gemacht werden. Die "Schwere Kette" beinhaltet die Oxidase-Funktion, während die "Leichte Kette" den Kristallisationsvorgang steuert.

Der Kern kann bis über die Hälfte der Gesamtmasse des beladenen Ferritins ausmachen, was für eine "wirtschaftliche" Art der Speicherung spricht. Laut Wikipedia wird der Komplex aus 24 Untereinheiten gebildet, die jeweils ca. 170 bzw. 180 Aminosäuren lang sind.

Um den Beladungsgrad der Ferritine zu berechnen kann man eine zweite Analyse machen, die die Konzentration an Proteinen aus der Probe bestimmt. Als Summenparameter könnte man den Stickstoffgehalt bestimmen, der dann mit dem Stickstoffgehalt der Proteinsequenz verglichen wird.



Du hast die Massenkonzentration an (beladenem) Ferritin. Um den "Beladungsgrad" bestimmen zu können brauchst Du die Konzentration an Eisen(-kristalleinheiten), die über die Analyse bestimmt wurde. Jetzt müßte es eine Differenz ergeben, die die "Taramasse" der Proteinhüllen ergibt. Mit der Molmasse der Hülle und der Anzahl der Untereinheiten je Hülle verrechnet müßte man auf die Anzahl an Eisenatomen je Protein kommen.


Hinweis: Vereinfachende Annahmen darf man nur dann machen, wenn sie nicht zu Zirkelschlüssen führen und ihre Auswirkung auf das Ergebnis (beweisbar) irrelevant klein ist. Beim "Gleichionischen Zusatz" kann man die Konzentration gelöster Ionen aus dem Bodenkörper vernachlässigen, wenn der Zusatz mindestens 2-3 Zehnerpotenzen größer ist, als die mögliche Konzentration ohne Zusatz.

[Pok]

Ich würde mir überlegen, wie z.B. 100 g Ferritin zusammengesetzt sind. Vieviel Gewichtsprozent sind davon Eisenkerne und wieviel das restliche Apoferritin? Wenn du diese 2 Werte hast, kannst du auch die Anzahl der Eisenatome im Gesamtprotein bestimmen.

Du hast eine Konzentration von Fe(II)-Ionen ermittelt, vermutlich in mol/l. Angenommen, die Konzentration des Fe(II) in diesen 50 µl Probelösung betrug 1,79 µmol/l.

Dann berechne erstmal die Stoffmenge bezogen auf die gesamte Menge der eingesetzten Ferritinlösung. 50 µl sind 1/20.000stel von 1 Liter, also enthält die 50-µl-Probe 89,5 pmol Fe(II). Daraus berechnest du die die Masse dieser Eisenatome.

m = M n (M = Atommasse von Eisen = 55,845 g/mol)

Damit kommt man auf 5 ng Eisenatome.

Ein Mol Eisenatome wiegt 55,845 g. Da im Eisenkern pro Eisenatom aber noch weitere (Nicht-Eisen-)Atome enthalten sind, erhöht sich das Gewicht des Eisenkerns ja auf diese 97,7 g pro mol Eisenatome. Also kannst du die Masse der Eisenkerne berechnen, indem du die Masse der Eisenatome mit dem Faktor multiplizierst, der aus dem Quotienten dieser beiden Molmassen resultiert (97,7 / 55,845 = 1,7492), womit du auf 8,746 ng Eisenkerne kommst.

Jetzt kannst du den Massentanteil der Eisenkerne im Ferritin berechnen (du hattest 50 µl 0,5 mg/l eingesetzt, also 25 ng Ferritin). 8,75 ng Eisenkerne in 25 ng Ferritin = 35 Gewichts-%. Der Rest (65 %) ist das Apoferritin. Die Molmasse des Apoferritins kennst du auch.

Rechne beispielhaft mit 100 g Ferritin. Darin sind nach dem Beispiel 65 %, also 65 g Apoferritin enthalten, also 137,12 µmol. Die restlichen 35 % sind Eisenkerne, also 39,777 mmol Eisenkerne. Jetzt berechnen, wieviele mol an Eisenkernen auf 1 mol Apoferritin kommen: 39,777 mmol / 0,13712 mmol = 290 mol Eisenkerne pro mol Apoferritin, also 290 Eisenkerne pro Ferritin-Molekül. Da jeder Kern 9 Eisenatome enthält, sind in einem Molekül Ferritin 2610 Eisenatome enthalten.

[guitar_player]

Vielen Dank euch beiden!

Tatsächlich kam ich zur Lösung, nachdem ich die Nettomasse an Apoferritin berechnet hatte, wie von Glaskocher beschrieben.

Danke!