Anthocyane sind im Pflanzenreich eine fast universell verbreitete Stoffgruppe und für die meisten rot-lila bis blauen Färbungen verantwortlich. Ihr Grundkörper ist ein Flavylium-Kation, durch verschiedene Substituenten (meist Hydroxy- und Methoxy-Gruppen) ergibt sich das sogenannte Anthocyanidin. Dieses ist der Chromophor, liegt in der Pflanze aber nicht frei, sondern glycosidisch an verschiedene Zucker gebunden, vor- so ergibt sich eine große Vielfalt an Farben, die für Pflanzen oft charakteristisch ist. Durch Analyse der genauen Verteilung mittels HPLC kann z.B. bei Wein sogar die Herkunft bzw. Rebsorten-Zusammensetzung bestimmt werden[7].
Diese Tabelle gibt einen kleinen Überblick über die Vielfalt der Verbindungen und ihr Vorkommen[1, 2, 3]:
Geräte:
Reagenzgläser, Pipetten, Wasserbad, Uhrglasschalen, DC-Platten und DC-Kammer
Chemikalien:
Salzsäure 2N
Ethylacetat
1-Pentanol
Ameisensäure
Toluol
Methanol
Butanon
Durchführung:
Zur Herstellung des Anthocyanidin-Extrakts werden einige Blütenblätter in einem Reagenzglas mit wenigen ml 2-molarer HCl für 45 Minuten am (fast) siedenden Wasserbad erhitzt. Gelegentlich kann mit einem Glasstab umgerührt werden, zerreiben ist jedoch nicht notwendig, da die Blätter von der heißen HCl aufgeschlossen werden. Nachdem die Lösung ausgekühlt ist, wird durch ein kleines Stück Watte in ein Reagenzglas filtriert.
Zuerst wird der Extrakt zweimal mit wenigen ml Ethylacetat ausgeschüttelt (zur Entfernung von anderen farbigen Stoffen wie zB Flavonoiden) und nach dem Abpipettieren im heißen Wasserbad restliches Ethylacetat vertrieben. Nun wird mit wenigen ml 1-Pentanol ausgeschüttelt, dabei geht der Großteil der Anthocyanidine in die organische Phase über. Die organische Phase wird mit einer Pasteur-Pipette vorsichtig entnommen und auf einer Uhrglasschale am Wasserbad auf ca 1/3 eingeengt. Das so erhaltene Konzentrat kann direkt zur DC benutzt werden.
Nach gleicher Methode wurden ebenfalls Extrakte bzw. Konzentrate von Rotwein ("Zinfandel"; 10 ml Rotwein + 2 ml konz. HCl), Heidelbeeren und Auberginenschale hergestellt.
Laufmittel für die DC (Kieselgel 60): Ethylacetat + Toluol + Ameisensäure + Wasser = 10 + 3 + 1,2 + 0,8
Die Rezeptur ist für ein gutes Trennergebnis genau einzuhalten!
Zum Auftrag werden Kapillaren von 0,3 mm Innendurchmesser benutzt und möglichst schmale Streifen gespottet. 1-Pentanol zerfließt auf Kieselgel nur sehr wenig, das unterstützt einen konzentrierten Auftrag. Allerdings muß es vor der Entwicklung gründlich abgefönt werden!
Die Anthocyanidine liegen recht schmal beieinander, sind aber noch klar getrennt. Die Rf-Werte reichen von 0,20 - 0,33 (Details siehe Bilder). Wenn die Ameisensäure aus dem Laufmittel langsam abdampft, treten die Farbunterschiede noch deutlicher hervor, was für die Identifikation hilfreich ist. Allzu lange darf man jedoch nicht zuwarten! Die Farbstoffe sind labil und nach einem Tag fast vollständig verblasst.
Zur Herstellung des Anthocyan-Extrakts werden einige Blütenblätter mit einer geringen Menge (ca 1 ml) an methanolischer HCl (ca. 1% konz. HCl in Methanol) ungefähr 10 Minuten bei Raumtemperatur im Reagenzglas mit dem Glasstab verrieben. Die Lösung wird ebenfalls durch ein kleines Stück Watte in ein Reagenzglas filtriert und im Vakuum-Exsiccator auf ca. die Hälfte des Volumens eingeengt. Erwärmen sollte hier unterbleiben, um die Glycoside nicht zu spalten. Das so erhaltene Konzentrat kann direkt zur DC benutzt werden.
Laufmittel für DC (Kieselgel 60): Ethylacetat + Ameisensäure + Wasser = 14 + 3 + 3
Die Rezeptur ist für ein gutes Trennergebnis genau einzuhalten!
Zum Auftrag werden Kapillaren 0,3 mm Innendurchmesser benutzt und möglichst schmale Streifen gespottet. Wegen des HCl-Gehalts des Extrakts muß vor Entwicklung gründlich abgefönt werden!
Die Aglycone laufen damit im Bereich >0,8 und sind eher schlecht getrennt, Monoglucoside und Acetylierte Anthocyane sind in etwa im Bereich 0,3 - 0,5, Diglucoside oder Triglucoside darunter. Diese Informationen sind nur ein grober Trend und Anhaltswert, genaue Literaturangaben dazu sind sehr schwer zu finden. Auch zur mengenmäßigen Verteilung der Anthocyane gibt es kaum klare Angaben, selbst in der Struktur widersprechen sich die Literaturstellen teilweise und natürlich ist die Verteilung auch sorten- und regionsspezifisch. Eine Interpretation ist daher nur teilweise möglich bzw. nur, wenn eindeutige Referenzsubstanzen vorliegen. Wenn die Ameisensäure aus dem Laufmittel langsam abdampft, treten die Farbunterschiede noch deutlicher hervor was für die Identifikation hilfreich ist - grundsätzlich bleibt der Farbton des Chromophors auch in den Glykosiden erhalten. Die Farbstoffe sind deutlich stabiler als die Aglykone und nach einem Tag noch gut erkennbar. Durch Bedampfen mit Ammoniak kann eine weitere Farb-Differenzierung erzielt werden, dann sollte aber sehr rasch fotografisch dokumentiert werden, da die Farben danach binnen weniger Minuten verblassen.
Wenn man die Polarität des Laufmittels erhöht (Ethylacetat + Ameisensäure + Wasser = 16 + 5 + 5), steigen die Rf-Werte der Anthocyane, die Auftrennung wird aber nicht wesentlich besser, teils sogar schlechter. Erstaunlich war lediglich, dass beim Mohn-Extrakt auf einmal ein weiterer Spot mit niedrigem Rf erkennbar wurde, der der Farbe nach dem Cyanidin zuzuordnen sein sollte.
Entsorgung:
Die Lösungen können nach Neutralisation zum Abwasser gegeben werden, Laufmittel kommt zu den halogenfreien Abfällen.
Erklärung:
Durch Erhitzen mit verdünnter Salzsäure kann aus dem Anthocyan der Anthocyanidin-Grundkörper (das sogenannte Aglykon) leicht hydrolysiert und gelöst werden, dieses kann dann mittels DC analysiert werden. Extrahiert man mit methanolischer HCl, so erhält man die unzersetzten Anthocyane.
Bilder:
Versuch einer Interpretation mit Hilfe der Literatur[4,5,6]:
1 = Cyanidin 3,5 Diglucosid
2 = Pelargonidin 3,5 Diglucosid
3 = Cyanidin 5 Glucosid
4 = Pelargonidin - 5 Glucosid
5 = Delphinidin - ?
6 = Delphinidin 3,5 Diglucosid
7 = Delphinidin 3 p-Coumaroylrutinosid-5-glucosid (Nasunin)
8 = Pelargonidin 3 Rutinosid-5-glucosid
9 = Cyanidin - 3-Cellobiosid
10 = Pelargonidin 3-Cellobiosid
11 = Cyanidin 3-Glucosid
12 = Pelargonidin 3-Glucosid
Links - Durchlicht; Mitte - UV365nm; rechts - Durchlicht nach Bedampfung mit NH3
(jeweils v.l.n.r. Rose, Aubergine, Klatschmohn; die Skala sind Rf-Werte)
Literatur:
[1] KONSTITUTION UND VORKOMMEN DER ORGANISCHEN PFLANZENSTOFFE (EXCLUSIVE ALKALOIDE); ISBN 978-3-0348-5143-5
[2] HANDBUCH DER LEBENSMITTELCHEMIE - ERSTER BAND - DIE BESTANDTEILE DER LEBENSMITTEL; ISBN 978-3-642-46012-8
[3] Phytochemical Methods A GUIDE TO MODERN TECHNIQUES OF PLANT ANALYSIS; ISBN-13: 978-94-010-8956-2
[4] Journal of Chromatography A, 1289 (2013) p.105– 118
[5] Chromatographia 11, (1978), p.193–196
[6] Anthocyanins and their Sugar Components. By J. B. HARBORNE, in: L. Zechmeister (ed.), Fortschritte der Chemie Organischer Naturstoffe; Vol. 20, Springer-Verlag Vienna 1962; ISBN 978-3-7091-7155-4
[7] Mitteilungen Klosterneuburg 52, (2002), p.187-194
