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zytochemischer Nachweis von Eisen
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zytochemischer Nachweis von Eisen

Der Begriff Zytochemie bezeichnet eine Reihe von Techniken mit denen bestimmte Stoffe innerhalb lebender oder (meistens) fixierter Zellen nachgewiesen werden können. Das Reaktionsprodukt ist entweder selbst farbig oder lässt sich durch Fluoreszenz sichtbar machen. Mit Hilfes des Mikroskops kann der Ausfall der Reaktion an jeder einzelnen Zelle beurteilt werden. Werden statt einzelnen Zellen ganze Gewebeproben untersucht, so spricht man von Histochemie. Die klassische Zyto- (oder Histo-)Chemie lässt sich in zwei Gruppen einteilen:

Substratnachweise: hier wird mit einer klassischen nasschemischen Nachweisreaktion gearbeitet. Beispiele sind der Eisennachweis oder die PAS-Reaktion zum Nachweis von Polysacchariden.
Enzymnachweise: hier wird das Vorhandensein bestimmter Enzyme nachgewiesen, indem man die Probe mit einem Substrat inkubiert, das durch das gesuchte Enzym in ein farbiges Reaktionsprodukt umgewandelt wird. Peroxidasen, saure und alkalische Phosphatasen, unspezifische Esterasen und andere lassen sich so erkennen.

Die moderne Zytochemie bedient sich in immer größerem Maße immunologischer und genetischer Methoden. Unter Immunzytochemie versteht man den Nachweis bestimmer Biiomoleküle auf der Zelloderfläche oder im Zytoplasma, mit Hilfe eines spezifischen Antikörpers, der an ein Enzym (meist alkalische Phosphatase) gekoppelt ist. Der Antikörper bindet an die Zielstruktur und in einem zweiten Schritt wird über die alkalische Phospahtase eine Farbreaktion ausgelöst, mit der die gebundenen Antikörper sichtbar gemacht werden. Die Zahl der so nachweisbaren Biomoleküle ist schier unbegrenzt.
Die - vorläufig - letzte Entwicklung auf diesem Gebiet ist die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, kurz FISH genannt. Dabei werden Gensonden, die an ein fluoreszierendes Molekül (meist Fluorescein oder Phycoerythrin) gekoppelt sind, mit den Zellen inkubiert. Liegt in der Zelle ein der Sonde komplementärer Genabschnitt vor, so wird sie gebunden und kann im Mikroskop anhand ihrer Fluoreszenz im UV-Licht als leuchtender Punkt erkannt werden.

Zytochemische Methoden sind aus der biologischen Forschung und der Medizin nicht mehr wegzudenken. Vor allem in der Diagnostik und Klassifikation von Krebserkrankungen, ja sogar in der Wahl einer spezifischen Therapie, spielen sie eine große und weiter zunehmende Rolle. Sollen zur Behandlung eines Brustkrebses Hormonblocker eingesetzt werden (z.B. Tamoxifen), so muss zunächst der (immunzytochemische) Nachweis geführt werden, dass die Zellen überhaupt Hormonrezeptoren aufweisen. Wenn sich über eine FISH-Reaktion zeigen lässt, dass die Zellen zudem den Wachstumsfaktor Her2/neu überexprimieren, so steht gegen diesen eine spezifische Antikörpertherpie zur Verfügung.

Begonnen hat diese Entwicklung vor etwa 150 Jahren, als der Pathologe Max Perls (1854-1894) zum ersten Mal den Einsatz der altbekannten Berliner-Blau-Reaktion zum Nachweis von Eisen in Gewebeproben beschrieb. Die auch heute noch sehr häufig eingesetzte Methode wird manchmal noch als “Perls‘ Stain“, meist jedoch schlicht als “Eisenfärbung“ bezeichnet. Sie wird im Folgenden beschrieben.


Material/Geräte:

Mikroskop, Färbebank, Pinzetten, Waschflasche mit Aqua dest.
Waage, Messzylinder, Erlenmeyerkolben, Messkolben 100 ml, Kleines Bechergläschen, kleiner Trichter mit Filter


Chemikalien:

Kaliumhexacyanidoferrat(II), Trihydrat

Salzsäure (C)


Fuchsin (C.I. 42510) (Xn)


Neutralrot (C.I. 50040)

Ausstriche von Blut, Knochenmark oder sonstigem Zellmaterial (B)




Sicherheitshinweise:

Mit Handschuhen arbeiten!


Versuchsdurchführung:

Herstellung der Reagenzlösungen:
Blutlaugensalzlösung: 2 g Kaliumhexacyanidoferrat(II) werden in 100 ml destilliertem Wasser gelöst und 2 ml 1 N Natronlauge zugegeben.
Salzsäure ca. 0,5 N: 5 ml rauchende Salzsäure werden mit dest. Wasser auf 100 ml aufgefüllt
Neutralrot-Fuchsin-Lösung: 0,5 g basisches Fuchsin und 1 g Neutralrot in 100 ml destilliertem Wasser lösen (Stammlösung). Zum Gebrauch 4 ml Stammlösung mit destilliertem Wasser auf 100 ml auffüllen.

Färbevorschrift:
Die Ausstriche werden gründlich an der Luft trocknen gelassen und mit der beschichteten Seite nach oben auf die Färbebank gelegt. In einem kleinen Becherglas mischt man gleiche Volumenteile der Blutlaugensalzlösung und 0,5 N Salzsäure und lässt die fertige Reagenzlösung über einen kleinen Filter auf die Ausstriche tropfen, bis diese vollständig bedeckt sind. Pro Objektträger benötigt man 3-4 ml Flüssigkeit. Man lässt 15 Minuten einwirken und spült die Ausstriche dann gut mit destilliertem Wasser ab (Spritzflasche).
Zur Gegenfärbung tropft man anschließend die gebrauchsfertig verdünnte Neutralrot-Fuchsin-Lösung auf die Ausstriche, lässt 30-60 Sekunden einwirken und spült mit destilliertem Wasser ab, bis keine Farbwolken mehr vom Präparat abgehen.
Die gefärbten Präparate lässt man trocknen und untersucht sie dann im Mikroskop zunächst bei schwacher Vergrößerung (100x) und zuletzt unter Zuhilfenahme der Ölimmersion (1000x). Eisen stellt sich als blauer Niederschlag vor dem rot gefärbten Hintergrund der Zellen dar. Während das Berliner Blau stabil ist, verblasst die Gegenfärbung allmählich im Lauf einiger Jahre.

Anmerkungen:
1. Die alkalische Kaliumhexacyanidoferrat-Stammlösung ist in einer dunklen Flasche ca. 1 Jahr haltbar. Stammlösungen sind sinnvoll, wenn man die Färbung oft durchführt. Statt das Reagenz aus Stammlösungen herzustelllen, kann man es auch ad hoc bereiten nach folgender Vorschrift: 0,5 g Kaliumhexacyanidoferrat(II)-trihydrat werden in ca. 40 ml Wasser gelöst, 1 ml rauchende Salzsäure zugegeben und mit Wasser auf 50 ml aufgefüllt
2. Für die Gegenfärbung kann auch eine Lösung von Kernechtrot-Aluminiumsulfat (10,0 g Aluminiumsulfat-18-Hydrat in 200,0 ml dest Wasser lösen und unter Erhitzen 0,2 g Kernechtrot (C.I. 60760) zugeben, abkühlen lassen und filtrieren.) verwendet werden, in die man die Präparate für 15 Minuten einstellt. Diese Gegenfärbung ist zeitaufwändig und hat gegenüber der oben beschriebenen Methode keine Vorteile.


Entsorgung:

Die gefärbten und ungefärbten Präparate werden mit den biologischen Abfällen entsorgt. Überschüssige Reagenzlösungen können ins Abwasser gegeben werden.


Erklärungen:

In lebenden Zellen kann Eisen in mehreren Formen vorliegen. Betrachtet man den Gesamt-Eisenbestand des menschlichen Körpers (etwa 4-5 g), so entfällt der Löwenanteil (etwa 80%) davon auf den roten Blufarbstoff Hämoglobin, in dem das Eisen komplex in einem Porphyrinring gebunden ist. Ein sehr kleiner Teil (50-80 mg) liegt als sogenanntes Funktionseisen in Enzymen, z.B. den Cytochromen der Atmungskette, vor. Das zweitgrößte Eisenkompartiment des Körpers bildet das Speichereisen. Speichereisen liegt im Körper überwiegend als Ferritin vor. Ferritine sind eine Klasse sphärischer Proteinmoleküle, die in ihrem Inneren einen "Kern" aus Eisen(III)-oxidhydroxid aufnehmen können. Eine Abbauform des Ferritins wird als Hämosiderin bezeichnet. Hämosiderin ist manchmal schon in der gewöhnlichen Lichtmikroskopie als braungelbe Körnelung in den Zellen erkennbar. Der zytochemische Eisennachweis ist spezifisch und extrem empfindlich. Bruchteile eines Pikogramms Eisen (das heißt weniger als 10-12 Gramm!) werden im Mikroskop sichtbar.

Die Berliner-Blau-Reaktion zum Nachweis von dreiwertigem Eisen ist allgemein bekannt. Für den korrekten Ablauf der zytochemischen Reaktion ist darauf zu achten, dass die fertige Reagenzlösung erstens nicht zu viel Blutlaugensalz (höchstens 1%) und zweitens genug Salzsäure (mindestens 0,2 M) enthält. Wenn letzteres nicht beachtet wird, so bildet sich statt des unlöslichen (Fe4[Fe(CN)6]3) nämlich das sogenannte lösliche Berliner Blau (KFe[Fe(CN)6] ?), das auf dem Präparat keine stabilen Niederschläge bildet (siehe dazu auch den Effekt des Ansäuerns der Waschlösung beim Fixieren von Cyanotypien!) Den Unterschied kann man sich demonstrieren, wenn man eine Kaliumhexacyanidoferratlösung im Überschuss zu einer stark verdünnten Lösung von Eisen(III)-Ammoniumsulfat gibt und einmal mit Salzsäure ansäuert, ein andermal nicht. Die angesäuerte Lösung färbt sich viel dunkler blau und flockt aus und das Filtrat ist klar. Die nicht angesäuerte Lösung läuft dagegen durch das Filter und gibt ein grünblaues Filtrat. Sogar in altehrwürdigen Lehrbüchern finden sich manchmal Rezepte für die Eisenfärbung, die zu wenig Salzsäure enthalten und deshalb nicht funktionieren!
Die Salzsäure wirkt außerdem fixierend auf die Zellen, d.h. sie fällt die Eiweiße unlöslich aus und erhält somit die Zellstrukturen, während bei Anwendung von destilliertem Wasser über osmotische Vorgänge eine Lyse der Zellen eintreten würde. Eine vorherige Fixierung der Präparate, z.B. mit Methanol, ist zwar möglich, aber unnötig und macht die Rektion sogar etwas weniger empfindlich.

Weil sich die Blutlaugensalzlösung im neutralen oder sauren Medium mit der Zeit von selbst zersetzt wird die Stammlösung leicht alkalisch eingestellt und das Reagenz vor der Anwendung filtriert, um artifizielle Niederschläge auf dem Präparat zu vermeiden. Mit etwas Übung kann der Mikroskopiker solche Artefakte aber gut von echtem Speichereisen unterscheiden. Bei Eisenmangel lässt sich im Knochenmark überhaupt keine Blaufärbung erkennen („Goldstandard“ in der Diagnostik des Eisenmangels). In diesem Fall muss man eine Positivkontrolle, einen Ausstrich mit bekannt vorhandenem Speichereisen, mitfärben um sicherzugehen, dass das Reagenz ordnungsgemäß arbeitet.


Literatur:
Douglas AS, Dacie JV: The incidence and significance of iron-containing granules in human erythrocytes and their precursors; J Clin Path 6 (1953): 307-13
Gale E, Torrance J, Bothwell Th: The quantitative estimation of total iron stores in human bone marrow; J Clin Invest 42(7), 1963: 1076-82
Grüneberg H: Siderocytes: a new Kind of Erythrocytes; Nature 148 (1941): 114-5
Perls M: Virchows Archiv 39 (1867): 42 ff.


Bilder:



Färbung eines Knochenmarkausstriches: Auftropfen der Reagenzlösung über ein Filter




Bei hohem Eisengehalt bemerkt man schon makroskopisch eine grünlichblaue Färbung des Präparates




Gegenfärbung mit Neutralrot-Fuchsin-Lösung




Knochenmarkausstrich mit Nachweis von Speichereisen in den Makrophagen ("Fresszellen") der Markbröckchen bei geringer Vergrößerung.




Knochenmarkausstrich bei Eisenmangel: völliges Ausbleiben der Blaufärbung in den Markbröckeln.




Nachweis von Eisen im Zytoplasma mehrerer Makrophagen. Die Makrophagen besitzen einen ovalen Zellkern und ein ausladendes, unregelmäßig geformtes Zytoplasma. Die umgebenden kleinen Zellen gehören zu den Vorläufern der weißen (Leukozyten) und roten Blutkörperchen (Erythrozyten). Die Vorstufen der Erythrozyten nehmen Eisen von den Makrophagen auf und bauen es in Hämoglobin ein.






Pathologische Eisenablagerung in Plasmazellen, oben in der Pappenheim-Färbung als braunschwarzer Einschluss im Zytoplasma, unten in der Eisenfärbung blau dargestellt. Plasmazellen gehören zum Immunsystem und lagern unter normalen Bedingungen gar kein Eisen ein. Die Präparate stammen von einem alkoholkranken Patienten. Anhaltender Ethanoleinfluss bewirkt eine Eisenstoffwechselstörung mit unphysiologischer Eisenablagung, unter anderem in Plasmazellen (sogen. Plasmazellsiderose).




Pathologische Einsengranula in Vorstufen der Erythrozyten, den sogenannten Normoblasten. Diese Ablagerungen finden in den Mitochondrien statt, die ebenfalls Ferritin enthalten, unter normalen Umständen jedoch kein Eisen speichern. Da die Mitochondrien rings um den Kern gelagert sind, umgeben auch die blauen Körnchen ringförmig den Zellkern. Man nennt diese Zellen “Ringsideroblasten“. Sie sind ein Zeichen für eine schwere Reifungsstörung der roten Vorstufen und kommen bei sogenannten Myelodysplastischen Syndromen (MDS, erworbene Blutkrankheiten meist älterer Menschen) oder bei der seltenen angeborenen Sideroblastenanämie vor.




Demonstration von löslichem und unlöslichem Berliner Blau. Der Ansatz ohne Salzsäure (links) läuft durch das Filter. Unter Salzsäurezusatz (rechts) fällt des Berliner Blau aus.

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Danke für diesen interessanten Ausflug in die Zytochemie!

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