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Wichtige biologische/biochemische Puffer und Lösungen
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Wichtige biologische/biochemische Puffer und Lösungen

Analog zu der Liste mit den wichtigsten Nährböden und Bouillon`s, ist hier eine Übersicht über die wichtigsten biologischen Puffer und Lösungen.
Die meisten Puffer müssen mit einer Base oder Säure auf einen definierten pH-Wert eingestellt werden. Dafür ist ein pH-Meter erforderlich. Es ist ratsam, den pH-Wert einzustellen, wenn das Zielvolumen noch nicht erreicht ist. Man bleibt etwa 10 bis 15 % unter diesem. Erst wenn der pH-Wert eingestellt wurde, wird auf das Zielvolumen aufgefüllt. Damit soll verhindert werden, dass sich durch die Zugabe einer Base/Säure das Volumen ändert und damit die Konzentration der Puffersubstanzen abnehmen.

Hinweis: Dieser Artikel wird ständig aktualisiert und neue Rezepte hinzugefügt.



Puffer für Nukleinsäuren:

Je nach Verwendung (z.B. bei der Arbeit mit RNA) ist eine Behandlung mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) ratsam um Ribonukleasen zu inaktivieren. Dafür wird 1 ml DEPC auf 100 ml fertigen Puffer gegeben und anschließend autoklaviert. Sollte man Wasser für einige Schritte benötigen, so sollte dieses auch mit DEPC behandelt werden.

50 x TE-Puffer

TE-Puffer (TRIS-EDTA-Puffer) ist ein universeller Puffer für Nukleinsäuren, er hemmt störende Enzyme.

Zusammensetzung:
60,57 g Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS)
14,61 g Ethylendiamintetraessigsäure Dinatriumsalz (EDTA-Na2)
→ auf einen Liter auffüllen und mit Natronlauge und Salzsäure auf pH 8.00 einstellen.
→ um einen 1 x TE-Puffer herzustellen, wird 20 ml des 50 x-Stocks entnommen und auf 1 l mit destilliertem Wasser aufgefüllt. 1 x TE-Puffer ist üblich für die Arbeit mit Nukleinsäuren.

10 x PBS-Puffer

PBS-Puffer (phosphatgepufferte Salzlösung) ist nicht nur eine universelle Puffersubstanz, sondern auch für die Aufbewahrung und Arbeit mit lebenden Zellen geeignet. Es puffert die Zellen und Biomoleküle wesentlich besser als isotonische Natriumchlorid-Lösung, da er sehr nah an die Bedingung des Cytosols kommt.

Zusammensetzung:
80 g Natriumchlorid
20 g Kaliumchlorid
27 g Kaliumdihydrogenphosphat
142 g Di-Natriumhydrogenphosphat (wasserfrei)
alternativ 178 g Di-Natriumhydrogenphosphat Dihydrat
→ auf einen Liter auffüllen und mit Natronlauge und Salzsäure auf pH 7.40 einstellen.
→ um einen 1 x PBS-Puffer herzustellen, wird 100 ml des 10 x-Stocks entnommen und auf 1 l mit destilliertem Wasser aufgefüllt. 1 x PBS-Puffer ist üblich für die Arbeit mit Nukleinsäuren, Proteinen und Zellen.

50 x TAE-Puffer

TAE-Puffer (TRIS-Acetat-EDTA-Puffer) ist ein Puffer für die Agarose-Gelelektrophorese. Er dient sowohl als Basis für Agarose-Gele, als auch als Füllsubstanz für die Elektrophoresekammer.

Zusammensetzung:
242 g TRIS
57,1 ml Essigsäure, 100 % (Vorsicht: ätzend!)
18,61 g EDTA-Na2
alternativ 100 ml 0,5 mol/l EDTA-Na2-Lösung.
→ auf einen Liter auffüllen und mit Natronlauge und Salzsäure auf pH 8.30 einstellen.
→ um einen 1 x TAE-Puffer herzustellen, wird 20 ml des 50 x-Stocks entnommen und auf 1 l mit destilliertem Wasser aufgefüllt. 1 x TAE-Puffer ist üblich für die Gelelektrophorese.

50 x TBE-Puffer

TBE-Puffer (TRIS-Borat-EDTA-Puffer) ist ein anderer Puffer für die Agarose-Gelelektrophorese. Von seiner Wirkung und der Verwendung ist er nahe zu identisch mit TAE-Puffer.

Zusammensetzung:
540 g TRIS
275 g Borsäure
35 g EDTA-Na2
→ auf einen Liter auffüllen und mit Natronlauge und Salzsäure auf pH 8.00 einstellen.
→ um einen 1 x TBE-Puffer herzustellen, wird 20 ml des 50 x-Stocks entnommen und auf 1 l mit destilliertem Wasser aufgefüllt. 1 x TBE-Puffer ist üblich für die Gelelektrophorese.

Agarose-Gele

Agarose ist ein Polysaccharid aus Algen und dient der Auftrennung von Nukleinsäuren. Dazu befindet sich das Gel in einem Elektrolyt, welches unter Spannung steht. Positiv geladene Nukleinsäure wandern zur Anode durch das Gel. Üblich ist die Verwendung von einem Gel aus 1 % Agarose.

Herstellung:
100 ml TAE- oder TBE-Puffer werden in der Mikrowelle bis zum aufkochen erhitzt. Anschließend wird 1 g Agarose in den Puffer übeführt. Es wird noch einmal kurz aufgekocht. Dabei muss man aufpassen, dass die Flüssigkeit nicht überschäumt. Ist das Gel auf ca. 60 °C abgekühlt wird es in die Gel-Kammer gegossen, dabei sollte schon der Kamm für die benötigten Taschen in der Gel-Kammer eingebracht sein. Je nach Größe der Kammer, kann ein größeres oder kleineres Volumen genommen werden.
Wenn sehr häufig Agarose-Gele benötigt werden, empfiehlt es sich, ein größeres Volumen Gel anzusetzen (z.B. 500 ml) und es im Wärmeschrank bei 60 °C zu lagern. So steht das Gel für häufige Verwendungen fertig bereit

Ethidiumbromid-Färbelösung

Ethidiumbromid (EtBr) ist ein Fluoreszenzfarbstoff, welcher sich in die DNA und RNA einlagert. Dadurch sind unter UV-Licht (Transilluminator) DNA- und RNA-Banden sichtbar. In der Regel werden Agarose-Gele nach der Elektrophorese in EtBr angefärbt. Die Verwendung einer Färbewanne ist üblich.

Vorsicht: Zwar werden die Gefahren von EtBr oftmals überdramatisiert, allerdings handelt es sich um einen vermutlich krebserregenden und mutagenen Stoff, welcher nach alter EG-Einstufung mit ''sehr giftig, T+'' gekennzeichnet war. Es sollte unbedingt auf die Arbeit mit dem Reinstoff verzichtet werden und ersatzweise eine handelsübliche Stocklösung verwendet werden!
Da der Stoff hautresorptiv ist, müssen bei der Arbeit Nitrilhandschuhe getragen werden! Latexhandschuhe schützen nicht!



Herstellung:
100 µl einer 10 mg/ml Stocklösung werden in einem Liter TAE- oder TBE-Puffer gelöst. Um Gele anzufärben, werden diese für 10 Minuten in die Färbelösung getaucht (dafür nimmt man am besten einen Pfannenwender), anschließend in einem Wasserbad vom anhaftenden EtBr befreit.
Alternativ ist auch das einbringen in das Agarose-Gel möglich (2 mg/100 ml) oder die Zugabe in die Taschen mit Nukleinsäure.



Reagenzien für die Molekularbiologie


IPTG-Lösung



Isopropyl-beta-D-Thiogalactopyranosid (IPTG) induziert die Aktivierung eines lac-Operons, in dem es am lac-Repressor bindet. Dadurch kann man die Genexpression der Gene, die sich hinter dem Operon befinden, gezielt steuern. Der Vorteil von IPTG ist, dass es anders als Lactose nicht von Bakterien metabolisiert werden kann.

Herstellung:
Es werden 0,3 g IPTG in 10 ml 100 % Ethanol gelöst (Konzentration 30 mg/ml). Die Lösung wird bei -20 °C aufbewahrt.

Antibiotika-Lösungen für die Molekularbiologie

Antibiotika sind Stoffe, die Bakterien auf unterschiedlichste Art und Weise abtöten oder sie an der Vermehrung hemmen. Sie werden in Molekularbiologie benötigt um Bakterien mit Genen, die zur Resistenz gegen Antibiotika führen, zu selektieren. Sie werden zudem für diagnostische Verfahren benötigt. Häufig verwendete Antibiotika in der MoBi sind Ampicillin, Chloramphenicol, Penicillin, Streptomycin, Tetracyclin und Vancomycin.

Hinweis: Einige Antibiotika stehen im Verdacht karzinogen zu sein. Auf unnötige Exposition mit dem Reinstoff sollte verzichtet werden.



Herstellung:
Für die Arbeit in der Molekularbiologie beträgt die Stocklösung 50 mg/ml (die Konzentration ist je nach Anwendung variabel). Die Konzentration im Medium beträgt in der Regel 50 µg/ml, diese kann durch Verdünnen erreicht werden.

Es werden 1 g Antibiotikum in 20 ml Lösemittel gelöst. Das Löslichkeitsverhalten unterscheidet sich teilweise stark voneinander:

Ampicillin: 50:50 Ethanol/Wasser
Chloramphenicol: 100 % Ethanol
Penicillin: Wasser
Streptomycin: Wasser
Tetracyclin: Wasser
Vancomycin: 50:50 Ethanol/Wasser



Lysis-Puffer

Standard Lysis-Puffer

Mit dem Standard Lysis-Puffer lassen sich eine Vielzahl von Zellmembranen lysieren. Die Lösung enthält ein anionisches Tensid, welches Biomembranen aufbrechen kann.

Zusammensetzung:
5 g Natriumchlorid
0,5 Natriumlaurylsulfat (eng. sodium dodecyl sulfate, SDS)
→ auf 100 ml Wasser.

Ggf. fällt das SDS aus, es löst sich wieder im Wärmeschrank bei 40 °C. Nur Puffer mit vollständig gelöstem SDS verwenden!

Lysis-Puffer für Plasmid-Präparation

Dieses Puffer ist für die Präparation von Plasmiden. Plasmide sind kleine extrachromosomale DNA-Fragmente in Bakterien.

Zusammensetzung:
1 g SDS
→ auffüllen mit 0,2 mol/l Natronlauge auf 100 ml.

Kaliumacetat-Lösung für Plasmid-Präparation

Die Kaliumacetat-Lösung dient bei der Plasmid-Präparation zur Neutralisation des Lysis-Puffer.

Zusammensetzung
3 mol K-Ac auf 100 ml Wasser
→ Einstellung mit Essigsäure auf pH 5.2. Achtung: Einstellen des pH-Werts bevor 100 ml Volumen erreicht wurde!

Lysozym-Puffer

Das Lysozym eignet sich für den bakteriellen Zellaufschluss über enzymatische Verdauung.

Zusammensetzung der benötigten 1 x-Puffers:
1,21 g TRIS Hydrochlorid (TRIS HCl)
0,372 g EDTA-Na2
→ auf einen Liter auffüllen

Anschließend erfolgt die Zugabe des Lysozyms: Konzentration: 50 mg/ml, es werden 0,5 Lysozym in 10 ml sterilem Wasser gelöst. Aufbewahrung erfolgt bei -20 °C.

Proteinase K-Lösung

Proteinase K spaltet als Peptidase Peptidbindungen.

Herstellung:
Die Arbeitskonzentration beträgt 10 mg/ml, dafür werden 0,1 g Proteinase K in sterilem Wasser gelöst. Diese ist bis zu 2 Jahre bei +4 °C haltbar.

Lyse mit nicht-ionischen Detergenzien

Für die Lyse von Zellen mit komplexeren Zellwänden (etwa Hefen), werden spezielle Lysis-Puffer benötigt, die ein nicht-ionisches Detergens enthalten. Häufig wird dafür Triton X100 verwendet.

Angesetzt wird eine Lösung mit 5 % Triton X100 in Standard Lysis-Puffer.

Da Triton X100, anders als SDS, keine Proteine denaturiert, kann es zur Lyse verwendet werden, wenn biologisch wirksame Proteine erhalten bleiben sollen. Statt Standard Lysis-Puffer wird hier z.B. DEPC-behandeltes Wasser verwendet.



es kommen weitere Rezepte noch dazu...

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Eine Coomassie-Färbelösung wäre auch noch etwas, aber da gibts ja 100 Varianten. Ich schau mal morgen welche ich neulich bei meinem Praktikum verwendet habe.

Wenn du schon das Agarosegel beschrieben hast, wäre eine Vorschrift für ein Polyacrylamidgel auch gut.
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