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Radioaktiver interner Standard
IllumiNobel-Gewinner 2012

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Unsere Arbeitsgruppe möchte in diversen Geweben die 1-alpha-Hydroxylase-Aktivität messen, dazu werden Nieren Mitochondrien isoliert und mit 25-Hydroxyvitamin D3 bei 37°C inkubiert.

Problem dabei ist, dass dann der Extrakt sich mit dem RIA http://www.idsplc.com/products/125-dihydroxy-vitamin-d-ria/ was ich da habe nicht messen lässt. D.h. die Proben müssten per SPE (C18) auf gereinigt vgl. http://www.jasco.hu/4tgrdvxgv/uploads/2017/05/IST-1021A.pdf und bei der Elution die "Recovery-Rate" bestimmt werden.

Perkin Elmer will für 5 µCi 1α,25-[26,27-3H]-Dihydroxyvitamin D3 4399.30 CHF haben, was für etwas was nur einige Monate hält und preislich jenseits von gut und böse liegt.


Meine Lösung für den internen Tracer wäre:

Eine größere Menge von Nieren Mitochondrien aus der Ratte zu isolieren und mit 25-[26,27-3H]-Hydroxyvitamin D3 zu inkubieren. Das 25-[26,27-3H]-Hydroxyvitamin D3 gibt es für 1435 CHF für 5 µCi, was erheblich billiger als der aktive Metabolit (1,25-Dihydroxvitamin D3) ist.
Würde diesen Extrakt dann über die "ISOLUTE SPE Column MFC18" vgl "IST-1021A.pdf" auf reinigen und per Scintillation Counter den Gehalt an 1α,25-[26,27-3H]-Dihydroxyvitamin D3 bestimmen und von dem Stock dann ein Aliquot als internen Tracer-Standard einsetzen. Laut einem Paper wird 5000 cpm 1α,25-[26,27-3H]-Dihydroxyvitamin D3 als Standard vor der Aufreinigung der Proben zugesetzt, was bei 168 Ci/mmol 0.225 nCi entsprechen sollte.


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Bj68
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NI2
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Klingt eigentlich ganz gut. Allerdings sollte man vorher einen oder besser mehrere Testruns mit nicht-tritiierterm Substrat laufen lassen. um zu schauen wie gut das ganze klappt und das Verfahren "kennenzulernen" und zu optimieren.

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IllumiNobel-Gewinner 2012

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Die sind schon gelaufen, mit Nieren-Extrakten von Experimentalmäusen ca. 100 Stück Blindproben (ohne Substrat) und mit Substrat. Gemessen wurden diese auch und einen fetten Unterschied zwischen Blank (Blind) und Positiv gab es, nur:

a) sprangen die Werte hin und her...
b) eine Probe hatte gar nichts drin, obwohl positiv...später ist mir aufgefallen, dass bei der Reaktion am Ende 2 Phasen sind, da die Reaktion im Protokoll mit ACN gestoppt wird....wahrscheinlich die falsche Phase erwischt.
c) Bei einer Wiederholung zeigten 2 Werte ein anderes Ergebnis...
d) Müssen die Proben delipidiert werden (Dextransulfat) und da habe ich meine Zweifel ob das mit den Organextrakten so gut geht...Plasma ist halt anders...


Bj68
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Illumina-Mitglied

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Die hier scheinen sowas Ähnliches gemacht zu haben:

Analytical Biochemistry Volume 96, Issue 2, 15 July 1979, Pages 481-488
Synthesis of 25-hydroxy[26,27-3H]vitamin D3 with high specific activity
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