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Nährmedium
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Herstellung fester Nährmedien

In diesem Versuch soll beschreiben werden, wie mit dem Geliermittel Agar-Agar und einigen Zusätzen wie Peptonen und Proteinen ein festes Nährmedium herstellt werden kann, welches sich sehr gut dazu eignet, eine Vielzahl von Mikroorganismen wie Pilze und Bakterien zu kultivieren und nachzuweisen.

Geräte:

Becherglas 100ml, Spatel/Löffel, Heizplatte, Chemikalienflasche 500ml (abhängig von der Anzahl der Agar-Platten), Petrischalen aus Kunststoff, Waage (mind. 0,1g genau), Dampfdruckkochtopf oder Autoklav, pH-Meter, Glasrührstab, Tesafilm, Tropfpipette, autoklavierbare Kunststofftüten, Schutzbrille, Einweghandschuhe, separater Abfallbehälter, "Hothand" oder Topflappen

Chemikalien:

Flächendesinfektionsmittel (C)

Händedesinfektionsmittel (F)

Agar gepulvert
Pepton aus Casein
Pepton aus Sojabohne
Pepton aus Fleisch
Natriumchlorid
Glucose
Trypton
Fleischextrakt
Dest. Wasser
Natriumhydroxid-Lsg. 0,1mol/l
Salzsäure-Lsg. 0,1mol/l
____________

Nährmedium mit Bakterien oder Pilzkultur



Hinweis:


Es ist sehr wichtig auf peinlichste Sauberkeit zu achten. Die Agarplatten sind gut gekühlt ungefähr 1 Woche haltbar.
Agarplatten mit Bakterienkulturen dürfen nicht mehr geöffnet werden. Es dürfen keine Ausstriche mit Abwasser angefertigt werden, da das Risiko der Bildung von Phatogen Keimen zu groß ist. Befindet sich der Arbeitsplatz in der Nähe eines Fensters, ist dieses während des Arbeitens geschlossen zu halten.
Die im Kühlschrank gelagerten Agarplatten müssen täglich auf Kontamination überprüft und aussortiert werden.

Durchführung:

Zuerst legt man sich alle Arbeitsmaterialien die für diesen Versuch benötigt werden zurecht. Die Arbeitsfläche auf der gearbeitet wird, wird mit dem Flächendesinfektionsmittel gründlich gereinigt. Je nach Stärke des Desinfektionsmittels sind Handschuhe und eine Schutzbrille zu tragen. Nun nimmt man sich die Substanzen und wägt wie folgt ein: Caseinpepton 7,5g, Sojamehlpepton 5g, Glucose 0,5g, Fleischpepton 5g, Trypton 5g, Fleischextrakt 5g, Natriumchlorid 2,5g, Agar 7,5g. Wurden alle Substanzen abgewogen, gibt man diese in die Chemikalienflasche und füllt anschließend diese auf 500ml auf.
Wenn sich alles gelöst hat wird mit dem pH-Meter der pH-Wert ermittelt und ggf. der pH-Wert mit der NaOH-Lsg. oder der HCl-Lsg. auf pH 7 eingestellt. Nun kann die Flasche leicht verschraubt werden. Der Deckel darf aber nur ganz leicht aufgeschraubt sein, damit die Flasche beim erwärmen nicht platzt. Die Flasche wird für ca. 2h bei voller Stufe (vom Kochfeld abhängig) im Dampfdruckkochtopf belassen damit der Agar schmilzt und sämtliche Bakterien abgetötet werden. Sind die 2h vorüber wird mit einer Hothand oder einem Topflappen die Flasche aus dem Topf entnommen, verschraubt und leicht umgeschwenkt. Somit ist gewährleistet das der Agar sich gut verteilt hat. Nach einer 15min. Pause kann der noch heiße Agar in die Petrischalen überführt werden, wobei darauf zu achten ist das der Deckel der Petrischalen nur leicht geöffnet wird und nach dem Befüllen sofort wieder verschlossen wird. Die Petrischalen werden nur bis zur Hälfte befüllt. Hat man nun den gesamten Flascheninhalt auf die Petrischalen verteilt, dürfen diese für 1-2h nicht mehr bewegt werden, damit sich der Agar in Ruhe verfestigt. Wenn die 1-2h vorüber sind, können die Petrischalen mit dem festen Agar, mit Tesafilm verschlossen, in den Kühlschrank gelegt werden und je nach bedarf wieder entnommen werden. Es ist wichtig die Agarplatten mit dem Herstellungsdatum und einer Bezeichnung zu versehen damit man sehen kann wie sauber man gearbeitet hat.

Entsorgung:

Verbrauchte und Kontaminierte Agarplatten, sowie Einmalartikel die bei der Herstellung angefallen sind, werden in einem autoklavierbaren Beutel gegeben und für 2,5h autoklaviert oder im Dampfdruckkochtopf erhitzt, damit alle Keime Abgetötet werden. Danach kann der Beutel dem Hausmüll zugeführt werden.

Erklärung:

Bakterien brauchen bestimmte Stoffe und Spurenelemente um sich zu vermehren. Wenn man Ihnen diese in Form von Proteinen, Kohlenhydraten und Salzen zur Verfügung stellt können sie diese verstoffwechseln und sich somit vermehren. Das Geliermittel Agar-Agar dient dabei als Trägermaterial der Nährstoffe.

Bilder:


Hier die verwendeten Chemikalien.


Abwägen aller Substanzen.


Sterilisieren des Nährmediums. Hier zum besser erkennen ohne Deckel.


Fertiges Produkt.


Beimpfte Agarplatte nach 48h
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Sehr schöne Dokumentation Very Happy Ich nehme an wir dürfen uns noch auf weitere Biochemie-Artikel freuen, ja ?
Eine Frage nur: Wozu hast du die Flasche Glycerol abgelichtet ? - brauchst du doch gar nicht...

mfg

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Ja, tut mir leid. Die is mir wohl dazwischen gehuscht.^^
Eigentlich wollte ich erst beschreiben wie man einen Nährbouillon herstellt aber dann dachte ich mir das der Närhragar
interessanter ist. Sorry!

mfg. Tim
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Überhaupt kein Problem ... merkt ja kaum jemand. Du kannst jetzt gerne noch einen Artikel zur Herstellung von "Pilzagar" (Sabourad) schreiben, dann darfst du das Bild gleich einsetzten Mr. Green Ich würde übrigens das "zum Nachweis von Keimen" aus der Überschrift herausnehmen; Nährmedien lassen sich ja nicht nur zum Nachweis sondern auch zur Kultivierung einsetzten, etc.

mfg

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Ok, wird erledigt.^^
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Is es denn ok wenn ich meinen ersten Beitrag als Vorlage für den Pilzagar nehme?
Habe jetzt eine gute Mischung entdeckt^^
mfg. Tim
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Interessant. Habe den aktuellen Esser hier. Da sind einige Nährböden für Pilze drin. Was für Pilze sollen es denn werden? oder ist das ein allgemeiner Nährboden?

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Das Nährmedium welches ich verwende ist vorallem für
eine Vielzahl von Pilzen geeignet.
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Hallo,
wieso autoklavierst du das Medium so lange?
In allen Vorschriften und Büchern wird von 15-20min gesprochen
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Es kommt eigentlich auf die zu autoklavierende Menge an, also nach dem Flaschenvolumen und der Beschickung des Autoklaven.
In stelle mir immer gleich eine große Menge an Fest und Flüssigmedium her, also so um die 5 Liter. Das spart Zeit und Energiekosten.
Die normale Sterilisationszeit beträgt 20-30min, ab dem Punkt an dem im Flüssigkeitsmittelpunkt die Sterilisationstemperatur erreicht ist.
Es empfiehlt sich daher auch eine Referenzprobe mit zu autoklavieren, während sich in dieser ein Temperatursensor befindet.
Also wie gesagt, je nach Bedingung ist die Zeit anzupassen. Hätte ich wohl erwähnen sollen, sry. Und nicht von den Fotos irretieren lassen, war nur zur veranschaulichung^^
mfg. Tim

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Mit freundlichen Grüssen,
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Es kam entwas verwirrend rüber^^

wie baust du denn bei dem Topf druck auf?
geht das?
und wie misst du die temperatur?
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Es gibt viele verschiedene Topfarten. Bei meinem wird der Deckel durch eine leichte Drehung Befestigt und sitzt somit fest.
Ebenfalls befindet sich im deckel ein Überdruckventil und ein Schließmechanismus, welcher das Öffnen im Druckzustand verhindert.
Den Temperaturfühler habe ich einfach durch einen Würgenippel oder auch Kabelverschraubung eingebracht. Ist eine Eigenkonstruktion, also
nicht zur Nachahmung empfohlen.

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Mit freundlichen Grüssen,
iTim
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okay, ich mache das gerne im autoklav.
Gibt es keine zeittabellen inder angegeben ist, wielange die flüssigkeit brauch, bis sie so warm ist?


Hast du keine Probleme damit, das die flüssigkeit verdampft?
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Ich denke, man kann sich das näherungsweise ausrechnen - wenn du weißt, wie hoch die Leistung der Heizplatte ist, so könnte ,man sich näherungsweise (!) ausrechnen, wie lange das braucht.

Bei 1l Wasser und einer wären das dementsprechend:

cWasser = 4,19kJ/kg ; m=1kg ; Δt=100° C (Bei einer angenommenen Autoklaviertemperatur von 121° C und einer Ausgangstemperatur von 21° C)

4,19kJ/kg * 100° C (Delta t) * 1kg = 419kJ

Bei einer Leistung der Heizplatte von 1000W sind das:

419000J / 1000J/s = 419s

419 Sekunden entsprechend also ca. 7 Minuten - real natürlich mehr, da die Energieübertragung auf den Topf natürlich nicht 100%ig ist, dementsprechend sollte man diese Angaben nur als ungefähren Richtwert verwenden, aus Erfahrungswerten sollte sich ein Faktor ergeben, mit welchem man die theoretische Angabe multiplizieren muss, um die Autoklavierdauer zu erhalten.

MfG

PS: Keine Gewährleistung für Richtigkeit Wink
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Du vernachlässigst da einiges. Die Rechnung kann näherungsweise gelten wenn die Energie von Flüssigkeit auf Flüssigkeit übertragen wird. Da die Flaschen im Autoklav allerdings rein über den Dampf geheizt werden dauert das ganze deutlich länger. Wenn man ganz penibel ist müsste man auch die unterschiedlichen Wärmeleitfähigkeiten in der Gasphase bei Luft/Wasserdampf separat angeben. Letztlich sind die Werte die in der Literatur angegeben werden empirischer Natur, da das ganze nicht so ohne weiteres berechenbar ist. Wir haben mal >4,5h gewartet bis ein großer Autoklav aufgeheizt, die Medien Steril waren und die Kiste wieder abgekühlt war obwohl die Praktikumsleitung von ca 2,5h ausgegangen ist und der gute Doktor O. macht den Job nicht erst seit gestern Wink

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