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Melanin
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Extraktion von Melanin aus Haaren


Melanin ist ein in der Natur weit verbreitetes Pigment, welches zum Beispiel die Haare braun bzw. rot färbt. Melanin hat viele interessante Eigenschaften, so bindet es z.B. eine ganze Reihe Medikamente (bekannt ist der Drogentest, bei dem Haare verwendet werden) und Giftstoffe (Blei und Nickel).

Geräte: Becherglas, Magnetrührer, Rührfisch, Zentrifuge, Bürette oder Tropftrichter, Zentrifugationsgefäße, Spatel, pH-Meter, Thermometer, Eisbad


Chemikalien:
Natronlauge (c=1 mol/L) (C)


Trinatriumphosphat (Xi)


Salzsäure 30% (C, Xi)


dest. Wasser
schwarze oder rote Haare


Hinweis:


Durchführung:
5g Haare werden in 5mm lange Stücke geschnitten, was am besten mit einer Schere geht (Mixer oder dergleichen war weniger zufriedenstellend) und bei Seite gelegt. Jetzt gibt man 250 mL Natronlauge in ein passendes Becherglas (min. 300 mL), fügt den Rührfisch hinzu und erhitzt die Natronlauge auf dem Magnetrührer auf 90°C (Rühren ist jetzt noch nicht nötig). Hat die Natronlauge die Temperatur erreicht gibt man die Haare hinzu und schaltet den Rührer ein. Es ist darauf zu achten, dass alle Haare in der Lauge sind und nicht am Rand des Becherglases hängen bleiben. Nach 10 min nimmt man das Becherglas von der Platte und stellt es ins Eisbad. Hat die Lösung Raumtemperatur erreicht fülllt man mit Wasser wieder auf 250 mL auf.

Im Folgenden werden die Zentrifugationsschritte beschrieben. Da die "Leistung" der Zentrifuge immer in g gemessen wird sind auch die Angaben in g. Da rpm und g über den Rotordurchmesser zusammenhängen kann man nicht einfach von g in rpm umrechnen. Falls Eure Zentrifugen nur rpm anzeigen müsst Ihr den Rotordurchmesser herausfinden und damit dann die benötigten Umdrehungen pro Minute festlegen.
Hier findet ihr die Formel dazu: http://doktor-schubert.net/2007/umrechnungstabelle-zur-zentrifugengeschwindigkeit/
Es ist möglich, dass man auch mit leistungsschwächeren Zentrifugen Melanin extrahieren kann, wenn man die Zeit erhöht. Da ist dann Eure Experimentierfreudigkeit gefragt
(Ich geb bei Gelegenheit an wie viel rpm das bei meiner Zentrifuge sind, damit ihr beim Überfliegen einen Anhaltspunkt habt)

Nun wird bei 650g für 5 min zentrifugiert, der Überstand in ein Becherglas gegeben und der Rückstand (nicht gelöste Haare oder nicht lösliche Verunreinigungen) verworfen. Die Lösung wird mittels Salzsäure auf pH 3 eingestellt. Dazu gibt man Salzsäure in einen Tropftrichter o.Ä., stellt die pH-Elektrode in die Lösung und lässt unter ständigem Rühren solange Salzsäure zutropfen bis sich der genannte pH-Wert eingestellt hat (den Differenzialsprung bedenken). Es fallen schwarze Flocken aus, die sich an der pH-Elektrode und dem Rührfisch absetzen. Ich habe einen unangenehmen, irgendwie brandeligen Geruch wahrgenommen, woher dieser kam kann ich nicht erklären, aber er trat immer bei diesem Schritt auf.

Man gibt nun alles in das/die Zentrifugationsgefäß/e und zentrifugiert bei 4600g für 10 min ab. In der Vorschrift waren 14680g angegeben, da meine Zentrifuge das aber nicht schafft, bin ich auf 4600g runter. Das Melanin hat sich trotzdem gut abgesetzt.

Nach dem Zentrifugieren wird der Überstand verworfen und der Rückstand in 200 mL Natriumphosphatpuffer (c=50mM) resuspendiert.( Um diesen Puffer herzustellen werden g Natriumdihydrogenphosphat in 1 L dest. Wasser gelöst. Das Pellet sollte mit einem Spatel zerkleinert und im Puffer verrührt werden. Diese Lösung wird nun auf pH 4,5 eingestellt. ) An dieser Puffergeschichte stimmt noch so einiges nicht, noch nicht nachmachen bis ich das eindeutig geklärt habe!

Es wird ein weiteres Mal wie zuvor zentrifugiert und der Überstand nach der Zentrifugation verworfen. Der Rückstand kann nun noch weiter gewaschen werden, z.B. mit EDTA um Schwermetalle zu entfernen. Da dies nicht unbedingt nötig ist gehe ich hier nicht näher darauf ein. Nach jedem Waschschritt wird wie oben zentrifugiert und in 200 mL Phosphatpuffer resuspendiert um Rückstände der Waschflüssigkeiten zu entfernen.

Nach der letzten Zentrifugation wird der Überstand verworfen und das Pellet in einer Petrischale oder einem Urglas verteilt. Das Pellet besteht hauptsächlich aus Melanin.

Als letzten Schritt gibt man die Petrischale in den Trockenschrank und trocknet das Melanin bei 80°C für einige Stunden. Das Melanin kann danach aus der Petrischale gekratzt und bei Bedarf zermörsert werden.

Ausbeute: leider hab ich das Melanin gleich weiterverwendet und vergessen eine Ausbeute zu bestimmen. Sobald ich den Versuch mal wiederhole werde ich das nachreichen.


Entsorgung:
Der Phosphatpuffer kann über den Abfluss entsorgt werden. Salzsäure und Natronlauge werden neutralisiert und können dann auch über den Ausguss entsorgt werden.

Erklärung:
Die Natronlauge lößt das Keratin und das Melanin auf, Letzteres wird dann wieder mit Salzsäure ausgefällt (die schwarzen Flocken). Es handelt sich letztendlich um eine Säure-Base-Extraktion. Keratin ist ein Protein, dass unter dem einfluss der Natronlauge denaturiert, weshalb es nichtmehr ausfällt (vermute ich). Das Melanin lößt sich aufgrund der Hydroxygruppen in der Natronlauge und kann dann wieder ausgefällt werden. Durch das mehrmalige Waschen mit Phosphatpuffer entfernt man die aggresive Lauge und Säure, sowie das bei der Fällung entstandene NaCl. Das Melanin liegt nach der Extraktion als schwarzes/braunes/rötliches Pulver vor.

Bilder:

Warum man beim Zentrifugieren niemals Glas verwenden sollte:


Das Melanin fällt im Sauren aus (einer meiner ersten Versuche bei denen ich noch Rund- und Erlenmeyerkolben benutzte):


Der Überstand nach der ersten Zentrifugation:


Melanin aus roten und braunen Haaren:


Zum Melanin

Melanin ist wie schon gesagt ein natürliches Pigment, dass in der Natur weit verbreitet ist. Melanin findet aufgrund seiner Eigenschaft diverse Stoffe zu binden eine große Interesse in der pharmazeutischen Forschung, allerdings ist die Struktur des Melanins nicht eindeutig zu klären. melanin verhält sich in den meisten Methoden zur Strukturaufklärung recht widerspenstig und vermutlich handelt es sich um ein Gemisch aus verschiedenen Polimeren. Bekannt ist das der Stoffwechsel des Melanins von der Aminosäre L-Tyrosin ausgeht, welches über mehrere Stufen zum Indol-5,6-chinon wird. Dieses polimerisiert dann zum Melanin (Näheres dazu hier: http://de.wikibooks.org/wiki/Biochemie_und_Pathobiochemie:_Tyrosin-Stoffwechsel). Die angegebene Strukturformel für Melanin ist allerdings so nicht allgemein gülltig, sondern lediglich eine von mehreren Theorien. Das schwarze Eumelanin unterscheidet sich vom roten Phäomelanin mit Sicherheit in seiner Struktur.

Quellen:
-abgewandelt nach: Karin Sono et al. Melanin-Based Coatings as Lead-Binding Agends, Bioinorganic Chemistry and Applications
2012, doi:10.1155/2012/361803
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Wie interessant doch Haare sind! Wink

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Alles ist Chemie, sofern man es nur "probiret". (Johann Wolfgang von Goethe 1749-1832)

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Der "brenzlige" Geruch dürfte auf zerstörte Disulfidbrücken zurück zu führen sein...

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Sehr schön erklährt! Smile
Zitat:
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Ja man braucht mich xD

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Finde ich sehr interessant. Muss ich beim nächsten Haare schneiden mal ausprobieren. Very Happy

@Rührfisch
Ist es unbedingt notwendig das du in fast jedem deiner post "xD" schreibst? Wie NI2 schon gesagt hat das ist hier kein Chat!
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Echt gut gemacht. Wenn ich jetzt noch Natriumphosphat habe, mache ich das nach .

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MfG HgO

"the only thing we have to fear is fear itself" Franklin D. Roosevelt
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Leider geht aus dem Text nicht hervor welches Natriumphosphat gemeint ist.

@ Feli
Es ist auch nicht nötig, dass du die Aufgaben eines Mods oder Assis wahrnimmst. Fass dir mal an die eigene Nase und kuck dir mal an wie oft du unnötigerweise die Zitierfunktion verwendest...

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Pok
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Stimmt, das mit dem Natriumphosphat ist unklar! Die Kurzbezeichnung "Natriumphosphat" ist nur für Na3PO4 üblich. Die Molarität (0,05 mol/l) stimmt auch genau mit dieser Verbindung überein (bei 8,2 g). Aber wie kann das sein? Na3PO4 bewirkt in Wasser bereits einen basischen pH. Da kann man nicht mehr mit Natronlauge auf pH 4,5 einstellen! Das ginge nur mit NaH2PO4, welches selbst schon bei ca. 10 g/l einen pH von ca. 4,5 zeigt.

Also vermutlich war hier tatsächlich Trinatriumphosphat gemeint, und dass man aber mit Phosphorsäure (!) statt Natronlauge auf pH 4,5 einstellt. Nur so macht das Sinn.
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Danke für den Hinweis mit dem Natriumphosphat. Ich habe Trinatriumphosphat benutzt, soweit ich mich erinnere habe ich den pH-Wert nicht weiter anpassen müssen. Das Anpassen des pH-Werts kommt erst nach dem Rehydrieren des (noch sauren) Rückstandes und wird folglich, falls nötig, mit Natronlauge durchgeführt.
Mann muss allerdings darauf achten, dass man im Sauren bleibt, da sich Melanin im Alkalischen löst und man so Melanin verwerfen würde.

Ich hab das oben verbessert und auch das Natriumphosphat in Trinatriumphosphat geändert.
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Pok
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Im Artikel steht der pH-Wert aber immer noch in Klammern zusammen mit der Molarität. Das liest sich so als hätte der reine Puffer bereits einen pH-Wert von 4,5. Der pH-Wert sollte besser aus der Klammer rausgenommen werden und stattdessen alles so wie in deinem letzten Post beschrieben werden. Den pH "wieder" auf 4,5 einstellen geht ja auch nicht. Schließlich stellt man ihn hier zum ersten Mal auf 4,5 ein.

Es wäre übrigens ziemlicher Zufall, wenn man durch Vermischen von Puffer und Pellet genau einen pH von 4,5 erreicht, wie in deinem Fall. Er könnte auch höher sein. Dann muss man mit Phosphorsäure statt Natronlauge auf 4,5 einstellen. Am besten schreibt man also nur "auf pH 4,5 einstellen" - ohne Natronlauge oder Phosphorsäure.

Das sind nur Kleinigkeiten, aber es liest sich so besser und vermeidet Missverständnisse.
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Sehr interessant und gut beschrieben, gefällt mir!
Ein paar Ungereimtheiten wären noch zu verbessern:

Zitat:
Da die "Leistung" der Zentrifuge immer in g Messe sind auch die Angaben in g.

soll vermutlich heißen "... immer in g gemessen wird ..."

Zitat:
... der Rückstand in 200 mL Natriumphosphatpuffer (pH 4,5; c=50mM) rehydriert. Um diesen Puffer herzustellen werden 8,2 g Trinatriumphosphat in 1 L dest. Wasser gelöst.

Da stimmt was ganz gewaltig nicht! Eine Trinatriumphosphatlösung ist, wie schon von Pok angemerkt, stark alkalisch. Man kann aus Trinatriumphosphat und Wasser keinen Puffer herstellen, der den pH 4,5 ergibt - das macht man nicht mal mit Natriumdihydrogenphosphat alleine. Die Lösung darf also nicht als "Puffer pH 4,5" bezeichnet werden, sondern es handelt sich schlicht um eine "0,05 M Natriumtriphosphatlösung", und im Verlauf des Versuchs wird dann der pH auf 4,5 eingestellt.

Pok hat Folgendes geschrieben:
Das sind nur Kleinigkeiten, aber es liest sich so besser und vermeidet Missverständnisse.

finde ich nicht. Das führt zu erheblichen Missverständnissen und sollte korrigiert werden.

Ausserdem ist der Begriff "rehydriert" (zu deutsch "wieder angefeuchtet") hier falsch gebraucht. Rehydratation setzt eine vorige Dehydratation - d.h. Trocknung - voraus, die aber nicht vorgenommen wurde. Du hast den Niederschlag (der sich ja nicht lösen soll) vermutlich in der Natriumphosphatlösung resuspendiert.

NB:
ich würde gerne noch was zur Chemie von Melanin erfahren! Schreibst du da noch was zu? Die Formel? Da könnte man auch erklären, warum sich das Präparat im basischen Milieu auflöst und im sauren ausfällt.
Und: bist du dir sicher, daß es das Melanin ist, das die Schwermetalle in den Haaren bindet? Ich habe da meine Zweifel! Haare enthalten ja jede Menge Keratin mit freien SH-Gruppen, da könnte ich mir die Bindung eher vorstellen als am (ja wie isses denn nun aufgebaut?) Melanin. Mindestens quantitativ sollte sie viel bedeutsamer sein.

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Pok
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lemmi hat Folgendes geschrieben:
Du hast den Niederschlag (der sich ja nicht lösen soll) vermutlich in der Natriumphosphatlösung resuspendiert.

So wird es auch in der Originalquelle bezeichnet. Wink
Da wird auch gesagt, dass der reine Puffer bereits einen pH-Wert von 4,5 hat und man nach dem Resuspendieren nochmal auf 4,5 einstellt. Wie der Puffer hergestellt wird, steht da aber nicht. Den sollte man einfach aus NaOH und Phosphorsäure herstellen statt Trinatriumphosphat zu nehmen.

lemmi hat Folgendes geschrieben:
Und: bist du dir sicher, daß es das Melanin ist, das die Schwermetalle in den Haaren bindet?

Ich bin zwar nicht Dithizon, aber im Artikel steht es so. Dazu werden da auch ein paar Versuche gemacht. Da steht auch, dass das Produkt nicht frei von Keratin ist, welches - wie du ja vermutest - auch Schwermetalle binden kann.
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Mir ist nicht klar, wie man einen Phosphatpuffer pH 4,5 mit einer vernünftigen Pufferkapazität herstellen soll. Die mir bekannten Phosphatpuffergemische hören bei pH 5,0 (untere Grenze) auf. Wirklich doof, daß die zusammensetzung nicht angegeben ist.

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Pok
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Mit Dihydrogenphosphat ginge noch ein Puffer von pH 1-3, aber bei 4,5 liegt fast genau der Äquivalenzpunkt, was also wirklich am ungeeignetsten wäre für einen "Puffer".
In dem Artikel wird der pH 4,5 "Puffer" später (nach dem Resuspendieren und vor einem weiteren Schritt) noch angesäuert, sodass er zu einem (echten) pH 2,2 Puffer wird. Das wäre ja möglich. Also vielleicht haben die einfach nur die NaH2PO4-Lösung schon dann als "pH 4,5 Puffer" bezeichnet, als es noch gar keiner war. Erst durch Zugabe von Säure wird daraus ein Phosphorsäure-Dihydrogenphosphat-Puffer mit einem pKs von 2,0.
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Das mit dem Puffer kann in der Tat nicht stimmen, selbst mit Natriumdihydrogenphosphat nicht. Das werde ich aufjedenfall nochmal nachprüfen und überarbeiten, bis dahin habe ich einen farbigen Vermerk gemacht.

Die Pufferkapazität ist bei einem solchen Puffer wirklich sehr gering, wobei ich nicht glaube dass es eine sehr wichtige Rolle spielt wie gut der Puffer hier puffert (blöd ist es hier natürlich trotzdem, da gar nichts angegeben ist). Man wollte denke ich mit dem Puffer verhindern, dass die Ansatzgröße durch viele pH-Einstellungen stark schwankt (da man darauf beim Zentrifugieren achten muss und die Zentrifugationsgefäße mitunter auch nicht die Größten sind)

@Pok: Das Ansäuern zum Schluss habe ich weggelassen, da das denke ich schon zum Beschichten dieser Scheiben gehört und mein Ziel ja Pulver war. Außerdem wird in der Vorschrift mit HCl und nicht mit Phosphorsäure angesäuert, wodurch kein Puffer entsteht.

Rehydriert wurde in resuspendiert geändert, danke für den Hinweis.

@lemmi: Ja ich bin mir sehr sicher das das Melanin die Schwermetalle bindet. Ziel meiner Untersuchungen war es die Bindung von Schwermetallen an Melanin und Haare zu untersuchen und Unterschiede zwischen verschiedenen Melaninen (Tintenfischtinte, rote Haare, braune Haare, schwarze Haare, Hundehaare...) zu finden. Das Keratin spielt denke ich bei dem Extrakt die deutlich kleinere Rolle als das Melanin, welches im deutlichen Überschuss im Extrakt vorhanden ist/sein sollte.
Anbei mal ein Ergebnis (Nachweis war die Dithizonmethode die ich hier auch schon vorgestellt habe):


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Melanin
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