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Lebendkeimzahl und OD
Eni
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hi Leute

Ich bin neu hier und hab da so meine Schwierigkeiten, ich hoffe ihr könnt mir helfen:)

Wenn ich eine Zelllösung verwende (pseudomonas putida) muss ich am Anfang immer eine MCFarland von 0.5 haben. Jetzt möchte ich gerne wissen, wieviele Lebendkeimzahl das sind. Kann ich also folgendes machen:

Ich inkubiere einfach mal eine Zelllösung. Diese wird so verdünnt, bis ich eine Absorbanz von ca. 0.11 - 0.12 habe (entspricht laut meinen Angaben MC Farland 0.5). Diese Lösung werde ich nun mittels Impföse auf Agarplatten aufstreichen in ein paar Verdünnungen und auszählen.

Ist das richtig? Kann ich das so machen?

mfg Eni247
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Würde ich auch so machen, allerdings musst du beachten, dass sich der MCFarland auf E. coli als Referenz bezieht. Die KBE die du bestimmst kann sich von dem erwarteten Ergebnis (1,5 x 108) unterscheiden.

Die Lösung solltest du übrigens nicht mit einer Impföse ausstreichen, sondern mit einem Drigalski-Spatel bei 100 µL Volumen. Musst halt gucken, ab welcher Verdünnung ein ausstreichen Sinn hat. Dann einfach hochrechnen.

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Eni
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Stimmt, Impföse macht ja nicht wirklich Sinn...

Das mit den 1.5 * 10^8 ist sowieso in allen Literaturen anderst dokumentiert. Ich hab da als Faustregel einfach 10^8.

Darf ich fragen ob du auch Erfahrung mit SAR Graphiken hast und 4pl Plot?
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Eni
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Weisst du vieleicht nicht was ich meine oder hast du es noch nicht gelesen?

Ich möchte eigentlich eine Auswertung vornehmen. In Mikrotiterplatten habe ich Biofilme gezüchtet, welche mit Tensiden behandelt wurden. Die Platte wird dann mit Kristallviolett gefärbt und spektroskopisch gemessen. Davon hätte ich gerne Auswertung mit Graphik und ggf. Plot. Wer kann mir weiterhelfen?

mfg Eni
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Ich kann dir auch nicht immer sofort antworten Wink Ich bin ja nicht 24 h Stunden hier.

Worum geht es denn genau? Was willst du genau machen? Die Dichte von adhärten Zellen in deinen Wells?
Und deren Absorption soll dann einfach photometrisch bestimmt werden?

Was ist deine konkrete Frage?

Darf man Fragen ob du das im Rahmen eines Hochschulpraktikums machen musst?

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Eni
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Entschuldigung, so wollte ich das natürlich nicht andeuten... Hab nur selber manchmal Mühe den Sachverhalt zu erklären. Ich versuchs nochmals.

Also ich muss in Mikrotiterplatten Pseudomonas Putida in Gegenwart von Tensiden untersuchen. Die Tensiden haben entweder eine Oberflächenablösende Wirkung oder eine bildungshemmende. Deshalb werde ich sie in den Wellplate züchten und mit den Tensiden behandeln. Der Restbiofilm wird mit Kristallviolett gefärbt und spektroskopisch analysiert. Nun habe ich eine Tabelle mit meinen Rohdaten, den Absorbanz werten. Meine Frage ist: Wie kann ich mit den Rohdaten ein (wenn ich richtig informiert bin) ein SAR Diagramm erstellen und ein 4PL Plot machen?

Ja ist richtig, ist für eine grössere Arbeit die ich zu machen habe. Leider tue ich mich ein bisschen schwer. Ich hoffe, dass macht nichts aus?

Edit: Kurze zusätzliche Frage zur Verdünnung meines Inokulum für MCFarland 0.5 (siehe oben). Würdet ihr das Inokulum mit Wasser oder Nährmedium verdünnen? Ich hätte jetzt steriles Wasser genommen für die Verdünnung
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Eni hat Folgendes geschrieben:
Wie kann ich mit den Rohdaten ein (wenn ich richtig informiert bin) ein SAR Diagramm erstellen und ein 4PL Plot machen?


Du musst ja eine Kalibrierreihe machen, ich nehme an, dazu deine Fragen zum MCFarland. Du musst deine Werte in ein lineares System bringen, d.h. in einen Logit-Plot. Dazu findest du Formeln im Internet, welche sich u.a. auf ELISA beziehen, aber auch hier anwendbar sein müssten. Auch findet man relativ schnell die mathematischen Hintergründe zur 4 parameter logistic, mit den man in Excel eigentlich eine Regression hinbekommen sollte. Mit der Steigung kannst du dann die Konzentrationen deiner Wells bestimmten. Im übrigen gibt es auch Onlineprogramme, mit denen du recht schnell und einfach mit der 4PL Methode deine Konzentrationen berechen kannst. Zwar sind die ausgelegt für Immunoassays, allerdings brauchst du prinzipiell nur die Werte deiner Standards eintragen.

Zugegeben, ich bin in dem Verfahren auch nicht so Sattelfest, aber was ich auf die schnelle gelesen haben, erscheint mir gut umsetzbar. Mit einigen Englisch- und Excel-Kenntnissen ist das machbar.

Eni hat Folgendes geschrieben:

Edit: Kurze zusätzliche Frage zur Verdünnung meines Inokulum für MCFarland 0.5 (siehe oben). Würdet ihr das Inokulum mit Wasser oder Nährmedium verdünnen? Ich hätte jetzt steriles Wasser genommen für die Verdünnung


Also wenn du direkt mit Zellen arbeitest, würde ich immer eine physiologische Umgebung wählen, d.h. dein Nährmedium oder PBS-Puffer (oder vergleichbares). Für die Arbeit mit Antigenen, Proteinen oder DNA kann man auch PBS nehmen oder halt eigene Puffer (TBS, TBST, TE etc.). Es kommt aber natürlich auch wieder darauf an, was du lösen willst. Für BSA reicht z.B. auch dest. Wasser.


Eni hat Folgendes geschrieben:

Ja ist richtig, ist für eine grössere Arbeit die ich zu machen habe. Leider tue ich mich ein bisschen schwer. Ich hoffe, dass macht nichts aus?


Wir helfen grundsätzlich immer gerne, allerdings haben wir uns bei Illumina vor einiger Zeit dazu entschlossen, bei Fragen für Praktika und Hausarbeiten nur Teilfragen zu beantworten. Grund hierfür ist das Konzept solcher Arbeiten, sich auch Wissen zu erarbeiten. Es bringt ja nichts, wenn Studenten immer alles Fragen, aber nicht selber recherchieren. Das ist jetzt kein Vorwurf gegen dich, deine Fragen find ich oke. Nur kann ich hier schlecht die Funktion für 4PL erklären, dass musst du selber machen.

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Also erstmals wieder danke für die ausführliche Antwort.

Hehe also es sind keine Hausaufgaben oder für ein Praktikum, das stimmt so nicht. Ich muss für die Schule ein Projekt erarbeiten, das ist alles. Ist nicht so, dass ich betrügen will oder so, ich tue mich einfach anfangs schwer, weil ich auch einfach keine Ahnung habe von diesen Sachen. Ist das erste mal das ich in der Mikrobiologie arbeite.
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Ich musste eben lachen, ich dachte du bist Student an einer Universität. Es ist eher ungewöhnlich (aber nicht unmöglich), dass sich Schüler damit beschäftigen.

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Ich fasse das mal als kompliment auf xD
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