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Konservierung von Mikroorganismen mit Glycerin
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Konservierung Von Mikroorganismen mit Glycerin

Einführung:

In diesem Versuch möchte ich einmal beschreiben, wie man Mikroorganismen für längere Zeit konservieren kann. In einem Vorversuch (Konservierung von Mikroorganismen), ging es um die recht aufwendige Konservierung mit Paraffin.
In diesem Versuch wird die Konservierung mit Glycerin realisiert.

Geräte:


Impföse (Stahl- oder Einweg-Ösen), Bunsenbrenner/Spiritusbrenner, Autoklav oder Dampfdruckkochtopf, wasserfester Stift, sterile Reagenzgläser, sterile Injektionsspritzen, Zellstofftücher, Einmalhandschuhe, Tiefkühltruhe (mind. -20°C),
Reaktionsgefäße (2,0ml), Etikettiergerät, Reaktionsgefäße-Ständer

Chemikalien:

Bakterienkultur


Desinfektionsmittel


sterile Kochsalzlösung (0,9%)

steriles Kulturmedium


Hinweise:


Es ist sehr wichtig auf peinlichste Sauberkeit zu achten. Befindet sich der Arbeitsplatz in der Nähe eines Fensters, ist dieses während des Arbeitens geschlossen zu halten.
Bei der Arbeit mit Mikroorganismen sind die allgemeinen Sicherheitsvorschriften für Laborarbeiten einzuhalten. Bei besonders empfindlichen Proben oder bei Pathogenen ist eine Sicherheitswerkbank zu verwenden.

Durchführung:


Zuerst legt man sich alle Arbeitsmaterialien die für diesen Versuch benötigt werden zurecht. Die Arbeitsfläche wird mit dem Flächendesinfektionsmittel gründlich gereinigt. Je nach Stärke des Desinfektionsmittels sind Handschuhe und eine Schutzbrille zu tragen. Bevor mit der Arbeit begonnen wird, muss der Bunsen- bzw. Spiritusbrenner entzündet werden. Mit Hilfe einer gut ausgeglühten Impfnadel wird ein wenig Zellmaterial aus der Vorkultur entnommen und in einem Reagenzglas mit ca. 2 ml steriler NaCl-Lösung suspendiert. Diese Zellsuspension wird in einem geeigneten Kulturmedium überführt und für 2 Tage bei geeigneter Temperatur, meist 35°C, bebrütet. Das Kulturmedium ist dem jeweiligen Stamm anzupassen (Pilze z.B. Malzextrakt-Kulturmedium, Bakterien z.B. CASO-Agar). Nun wird aus dieser Kulturlösung Zellmaterial entnommen und in 0,5 ml-Schritten in die Reaktionsgefäße überführt. Ebenfalls wird 1,0 ml steriles Glycerin hinzugefügt und beides gut durchmischt. Die Kulturen sind nun bereit zum einfrieren. Zur Vergrößerung der Zelldichte (Zellpellet) eignet sich, wenn vorhanden, eine Zentrifuge. Die Verwendung von Zellpellets erzielt eine bessere Lebensdauer und ist daher ratsam.

Erklärung:


Das einfrieren von Zellen ist immer mit großen Verlusten verbunden. Beim einfrieren gefriert das in den Zellen enthaltene Wasser und bildet dabei Eiskristalle, welche die Zelle von innen heraus zerstören (die Zelle platzt).
Bei Verwendung eines Frostschutzmittels, in diesem Fall Glycerin, wird dieses in die Zelle eingelagert und verdrängt dabei das Wasser. Da das Glycerin bei tiefen Temperaturen nicht gefriert, sondern nur seine Viskosität ändert, wird das Zellmaterial ideal geschützt.

Bilder:


Bakterienausstrich








Sterile NaCl-Lösung


Suspendiertes Zellmaterial


Das Kulturmedium. Man erkennt sehr gut die Trübung


Mischen der Kultur mit Glycerin


Vor dem Eifrieren


Die Lagerung der Kulturen
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Zusätzlich:
In der Regel, werden Bakterien bei -80°C gelagert. Da aber wohl kaum jemand eine Gefriertruhe mit einer kühlleistung von -80°C daheim hat, muss man halt auf übliche Mittel
zurückgreifen. In diesem Fall eine normale Gefriertruhe.
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Hey danke!
Ich beschäftige mich momentan sehr intensiv mit Mikrobiologie und dein Artikel hilft mir echt weiter (wie auch deine anderen Artikel)!

Toller Artikel! Very Happy

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Was heist das genau? Züchtest du auch Bakterien? Wie gesagt, suche ich noch interessierte, die Lust haben, eine eigene Kultursammlung aufzubauen und Stämme auszutauschen. Das ganze befindet sich noch in der Testphase. Mfg. Tim
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Ja auch, aber ich bin noch ziemlich am Anfang.
Aber ich mache natürlich gerne mit!

Ich bin momentan noch ehr in der Bestellphase. Very Happy
Vieleicht kannst du mir in mancher Hinsicht sogar "unter die Arme greifen". Very Happy

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Klar, mach ich gerne. Hast du denn schon was an Zubehör?
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Petrischalen, Reaktionsgefäße, Pipetten, Kanülen und Spritzen, Gasbrenner.
Agar, Glucose, Nähragar mit Pepton ist bestellt,
Abklatschlatten (bekomme ich von einer Freundin aus dem Krankenhauslabor),
diverses Chems wie Kochsalzlösung, EtOH.
Autoklav (ich benute einen Schnellkochtopf), Autoklavierebare Entsorgungsbeutel, Desinfektionsmittel

Impföse und Nährbodenflaschen werde ich mir demnächst bestellen (momentan habe ich mein Geld für das Nähragar und ein haufen Petrischalen ausgegeben).

Was mir fehlt, ist ein Inkubator. Aber ich will mal schaun ob ich einen günstig auf ebay bekomme.
Bisher improvisiere ich.
Einen eigenden Kühlschrank für Proben habe ich auch zur verfügung und ein kleines Mikroskop.

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iTim hat Folgendes geschrieben:
[...] und Stämme auszutauschen.

Ich hoffe du willst diesen Tausch nicht via normaler Post durchführen oder ? Ich bin mir nicht sicher ob es sinnvoll ist Kulturen (egal ob pathogen oder nicht) heutzutage im Päckchen weiterzuleiten ...

mfg

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Währe doch mal ganz interessant zu sehen, wie weit der Staat in die Privatsphäre eingreift. Nein, natürlich nicht.
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Es gibt noch ein weiteres Frostschutzmittel, nähmlich DMSO.

Vorteile DMSO:
-auch bei geringen Temperaturen flüssig
-wird schnell von den Zellen aufgenommen
-ist etwas besser in der Schutzwirkung als Glycerin (aber nur geringfügig)

Nachteile DMSO:

-toxisch (bei der Konservierung von Zellen, sollte das DMSO eine Konz. von 10% nicht übersteigen. Ideale Konz. beträgt 7%)
-nach dem auftauen muss Zellmaterial auf Nährboden übertragen werden
-aufwendig in der Beschaffung

Vorteile Glycerin:

-kostengünstig
-leicht beschaffbar
-nicht toxisch
-Zellmaterial ist nach dem auftauen einige Zeit aktiv, aber sollte möglichst bald auf Nährmedium reaktiviert werden

Nachteile Glycerin:
-wird etwas langsamer von Zellen aufgenommen
-je nach Temperatur und Konz. sehr viskos

Ich werde parallel zum Glycerin auch DMSO-Kulturen ansetzen, um dann vergleichen zu können.
Also, biss dann
mfg. Tim
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Wie wäre es mit einem anderen Glykol; vielleicht Ethylenglykol oder Triethylenglykol ? Die haben eigentlich ähnliche Eigenschaften.

mfg

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Weis nicht, aber ich habe noch nie davon gehört, dass diese in diesem Bereich Anwendung finden.
Werde mich aber nochmal genauer informieren.
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So, der Anfang meiner Stammsammlung währe schonmal geschafft^^

Kulturen von Bacillus subtilis, Streptococcus pyogenes, Micrococcus luteus, Penicillium camemberti, Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli

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Mit freundlichen Grüssen,
iTim
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Mal ne Frage. Kann man nicht einfach statt Flüssigmedium auch sterile Saline nehmen? Die kleinen werden ja sowieso durch die Kälte am Stoffwechsel gehindert. Sobald man dann Kulturen animpft oder ausstreicht haben die ja wieder alles was sie brauchen.
p.s.: Weiß jemand zufällig ne Seite auf der ich Infos zu Koloniemorphologien finde?

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Sicherlich ist die verwendung von Saline auch eine Möglichkeit, solange diese ein geeignetes Frostschutzmittel enthält.
Die Verwendung von Flüssigmedium ist in der Hinsicht ratsam, da es während des Gefrierprozesses zu einem Nahrungsstress-Zustand kommt und dadurch der
Verlust an lebensfähigen Zellen sich erhöt. Die Verluste bei der Gefrierkonservierung sind schon erheblich hoch wodurch man natürlich nicht durch osmotischen Stress
weitere vermährungsfähige Zellen verlieren möchte. In der Regel hängt die Verwendung von Saline auch von der Gefriergeschwindigkeit, sowie des Auftauprozesses ab.
Ich kann dir wie gesagt nur zur Verwendung von Flüssigmedium raten.

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Mit freundlichen Grüssen,
iTim
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