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Kongorot, Alcianblau und Sybrgreen
Eni
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Eine Frage, bezüglich Bakterienfärbung von P. putida mit Kongorot, Alcianblau und Sybrgreen. Wie kann ich die Färbung des Bakteriums für eine spektroskopische Messung wieder herauslösen? Würdet ihr einfach Ethanol abs. verwenden und kurz inkubieren?

mfg Eni
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Sollen die "Kleinen" beim Inkubieren sich wieder vermehren? Ich vermute, daß sie nach dem Färben und einer Alkoholbehandlung ziemlich tot sind. Was genau willst Du denn messen, wenn die Färbung wieder entfernt wurde? Oder soll nur der Überschuß entfernt werden, um die eigentliche Färbung besser erkennen zu können? Hier hilft eine genauere Fragestellung!


@All: Hier gibt es erste Antworten zur selben Originalfrage:
http://www.gutefrage.net/frage/bakterienfaerbung-mit-kongorot-alcianblau-und-sybrgreen#answers


PS: Interessanter Link zu Info über Mikroskopie und Färbungen:
http://www.aeisner.de/index.html
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Eni
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Ok 2. Versuch Very Happy

Ich möchte gern Zellzahl spektroskopisch messen. Wie sind sie so gewachsen. Dafür teste ich die drei Farbstoffe. Wellplate mit putida inkubieren, planktonische entfernen (Biofilm intressiert mich), färben, überschüssige färbelösung abwaschen, trocknen und dann Schritt x. Jetzt habe ich den gefärbten Biofilm ohne überschuss der Färbelösung mehr. Diese kann ich natürlich noch nicht spektroskopisch messen. Dafur muss ich ja zuerst die Färbung im Biofilm wieder in Lösung bringen. Hier die Frage, wie bringe ich das zu stande? Ethanol abs?

im Übrigens wenn ich richtig gelesen habe, ist das bei Sybrgreen gar nicht nötig. Der Farbstoff fluoresciert ja nur, wenn DNA gebunden ist, somit muss ich den Farbstoff im Überstand gar nicht entfernen
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Ich würde erstmal wissen wollen ob das überhaupt so geht, wie du dir das vorstellst.

Du willst - wenn ich richtig verstanden habe - die Zellzahl in deinem Bakterien-Biofilm dadurch messen, daß du den Biofilm erst färbst, dann die nicht an der Wand der wells haftenden Zellen herauswäschst und zuletzt die gefärbten Bakterien mit einem Lösungsmittel wieder entfärbst. Im Eluat willst du dann die Farbstoffkonzentration messen und die soll nach diesem Ansatz die Zellzahl der Bakterien widerspiegeln die gefärbt waren.

Richtig?

Wenn ich dein Vorhaben richtig wiedergegeben habe hätte ich erhebliche Zweifel ob das eine reproduzierbare und valide Methode ist!

Wie willst du sie eichen?
Woher weißt du, daß die Farbstoffmenge der Zellzahl proportional ist?
Wie willst du die Methode so standardisieren, daß die Ergebnisse reproduzierbar werden?
Wie willst du Fehler (Anhaften des Farbstoffes an der Gefäßwand etc.) ausschließen?

Hast du dir das selbst ausgedacht?

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Um einen Färbevorgang rückgängig zu machen muß man zunächst seinen Mechanismus verstehen. Im Beispiel wird der nicht fest am Amyloid gebundene Anteil Kongorot beim "Differenzieren" mit Ethanol ausgewaschen. Dies geschieht aber eher nach Augenmaß als nach einer reproduzierbaren Methode. Mikroskopische Färbungen sind meistens auf maximalen Kontrast optimiert, statt auf reproduzierbare Adsorption. Um die (gezielte) Desorption vom Substrat macht man sich überhaupt keine Gedanken (man fürchtet sie bei Mehrfachfärbungen).

Außerdem solltest Du zu jedem Farbstoff testen, welche Bestandteile der Kultur (Zellen und/oder extrazelluläre Matrix) gefärbt werden. Um die Zellzahl zu bestimmen müßte ein Farbstoff reproduzierbar von jeder Zelle gleich aufgenommen werden. Dann ist die Frage, ob man den Farbstoff wieder extrahieren will, oder gleich die ganze Probe "Püriert" und als Zelltrümmersuspension vermißt.


Als erste "Fingerübung" würde ich zu diesem Thema versuchen, einen Biofilm auf einem Stückchen Deckglas wachsen zu lassen. Der läßt sich dann färben und unter dem Mikroskop betrachten. Das sollte erste Anhaltspunkte geben, was wie stark und wie gleichmäßig gefärbt wird. Zellen der obersten Lage könnten die der tieferen Lagen recht effektiv vor Umwelteinflüssen (Färbung...) schützen. Das ist oft ein Grund für die bessere Überlebensrate von Biofilmen gegenüber planktisch lebenden Individuen. Sobald Du die Färbung im Griff hast solltest Du an diesen Präparaten die Entfärbung unter Erhalt des extrahierten Farbstoffes testen. In einem weiteren Schritt kommt dann die Quantifizierung des wiedergewonnenen Farbstoffes. Hier könnte der nächste "Knackpunkt" lauern, da die Farbstoffmenge, die vom Film eines "Näpfchens" ad/desorbiert wurde, recht klein ist. Die Konzentration in der Küvette wird also recht "dünne" sein und möglicherweise irgendwo im Grundrauschen verschwinden. Hier hilft eine Verdünnungsreihe des Farbstoffes (immer auf 1/10 verdünnen, eventuell noch 0,2 und 0,5 dazwischen setzen), mit der Du die sicher nachweisbare Grenzkonzentration des Farbstoffes bestimmst. Bis jetzt hast Du noch keine Relation von Zellzahl zu desorbiertem Farbstoff! Das wird noch eine "gewisse Herausforderung", um es mit "japanischer Ausdrucksweise"* zu sagen.


Bis zur reproduzierbaren Methode ist noch viel zu tun.



* = In Japan wird das Wort "NEIN" möglichst vermieden. Man formuliert "positivierte" Phrasen, um "sein Gesicht" vor seinem Gegenüber zu wahren.
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Eni
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Nun gut danke für eure ausfürhlichen Antworten. So wie es scheint war ich wohl zu optimistisch eingestellt.

Grüsse
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Kongorot, Alcianblau und Sybrgreen
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