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Klonierung DNA / Gelelektrophorese züsätzliche Bande?
Illumina-Mitglied

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Hallo,

Ich bin neu hier im Forum und habe direkt eine Frage.

Bei der Gelelektrophorese habe ich folgendes Bild erhalten.
Soweit so gut, aber bei der weißen Kolonie im NotI Verdau ist eine 3. Bande zu sehen. Normalerweise dürften das ja nur 2 sein.
Ich hatte erst Theorien darüber, dass vielleicht irgendwas gespiegelt hat oder das Gel zulange im Bad lag.

Herausgefunden habe ich, dass es am Restriktionsverdau liegt. Anscheinend ist da etwas nicht optimal verlaufen.
Kann mir da jemand vielleicht helfen?
Was ist denn das zusätzliche Fragment überhaupt?



Mit freundlichen Grüßen
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Re: Klonierung DNA / Gelelektrophorese züsätzliche Bande?
Illumina-Moderator

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AgarAgar hat Folgendes geschrieben:

Soweit so gut, aber bei der weißen Kolonie im NotI Verdau ist eine 3. Bande zu sehen. Normalerweise dürften das ja nur 2 sein.


Das kommt auf dein Plasmid an oder was du halt geschnitten hast. Und vorallem, was du überhaupt gemacht hast.


AgarAgar hat Folgendes geschrieben:

Ich hatte erst Theorien darüber, dass vielleicht irgendwas gespiegelt hat oder das Gel zulange im Bad lag.


Die Dauer des Bades dürfte keine Auswirkungen haben, was meinst du mit gespiegelt?


AgarAgar hat Folgendes geschrieben:


Herausgefunden habe ich, dass es am Restriktionsverdau liegt. Anscheinend ist da etwas nicht optimal verlaufen.
Kann mir da jemand vielleicht helfen?
Was ist denn das zusätzliche Fragment überhaupt?



Vielleicht hast du zusätzlich etwas heraus geschnitten (d.h. mehrmals die selbe Erkennungssequenz auf deinem Plasmid --> davon gehe ich am ehesten aus).
Wenn du nur NotI verwendet hast, dann dürftest du eigentlich auch nur ein Fragment erhalten, weil du ja eigentlich immer zwei Restriktionsenzyme brauchst um ein Fragment zu entfernen. Ansonsten schneidest du dein Plasmid ja nur auf und die Größe des Plasmid bleibt voll erhalten (es sei denn, du hast zweimal die Erkennungssequenz drin). Aber dazu kann ich dir nicht viel sagen, wenn ich nicht weiß, was es für ein Plasmid war.
Scheinen auch keine Primerwolken oder ähnliches zu sein, da zu groß.

Im übrigen wäre die Bezeichnung der Größen des DNA-Leiters hilfreich.

Gehe ich richtig in der Annahme, dass du eine Blau-Weiß-Selektion durchgeführt hast und nun gerne zur Kontrolle dein Gen in der weißen Kolonie nachweisen möchtest?

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Danke erstmal für die Antwort.

Also es ging um die Klonierung von DNA.
Zu Beginn hatte ich den pGEM-T Easy Vector und ein zu charakterisierendes Stück DNA (Insert=
cusCFBA), dass mehrere NotI- oder PstI-Schnittstellen enthält.
Das wurde kurz gesagt miteinander vermischt/kloniert.
Damit wurden dann anschließend E. coli Zellen transformiert.
Die Bakterien sollten halt die DNA aufnehmen.
Für die Selektierung habe ich dann Ampicillin genommen.
Ich wollte nur Bakterienklone haben, die mit dem Vektor eine Ampicillin-Resistenz erhalten
haben, welche für ß-Lactamase kodiert. Die sind dann gewachsen usw.
Ich wollte am Ende halt Zellen mit Vektor und inseriertem Fragment.
*Die weiteren Zwischenschritte sind glaube ich weniger relevant.*

Ich hab am Ende die Kulturen mit Ampicillin geimpft. Dann aus den Kulturen die Plasmid-DNA isoliert, um zu gucken, in welcher Orientierung zum lacZ´-Genfragment des Vektors sich das Insert in den Vektor einkloniert haben.
Mit Hilfe von Restriktions-Endonukleasen wurde das Ganze dann geschnitten.
Mit Hilfe der Gelektrophorese habe ich die Fragmente nach der Größe bestimmt.


Hier noch die Bandengrößen:





Mit gespiegelt, dachte ich, dasss beim Foto machen etwas vielleicht schief gelaufen ist, aber das kann ich ausschließen.

Anscheinend ist ja die Restiktionsreaktion nicht vollständig abgelaufen und deshalb beim NotI die 3. Bande oder?
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Illumina-Moderator

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Oke, jetzt ergibt alles auch mehr Sinn.

Es dürften eigentlich bei NotI nur zwei Fragmente vorhanden sein, da hast du recht. Da es nur eine Schnittstelle auf dem eigentlichen Plasmid gibt, hast du vielleicht eine Erkennungssequenz in deinem Insert.
Wie viele Basenpaare hat das Insert denn? Du kannst ja abschätzen, ob du dein Insert geschnitten hast. Das Fragment mit der größe von 3 kbp ist auf jedenfall dein Vektor. Bleiben die beiden anderen bei 6 kbp und 8 kbp.

Was auch möglich ist, dass es sich dabei um nicht geschnittenes Plasmid handelt. Kontaminationen kann man auch nicht ausschließen, was aber schon ein großer Zufall wäre.

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Illumina-Mitglied

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Also wenn mich nicht alles täuscht ist die Insert-DNA ca. 6804 bp groß. Unser Plasmid besteht ja zum einen aus dem Vektor und zum anderen aus der Insert-DNA. Das Plasmid soll 9804 bp groß sein (so wurde es vorgegeben) und der Vektor hat ungefähr eine größe von 3000.

Das einzige was ich bereits erfahren habe, laut meiner Dozentin, ist, dass es offensichtlich am Restriktionsverdau liegt. Irgendetwas soll nicht optimal gelaufen sein weshalb wir nun ein Fragment zusätzlich sehen.

Es tut mir leid für die vielleicht verwirrende Ausdrucksform^^ Ich bin in dem Gebiet nicht so ganz auf der Höhe ^^
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Klonierung DNA / Gelelektrophorese züsätzliche Bande?
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