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Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC)
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Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC - Hiph performance liquid chromatography)

Im Folgenden wird im kurzen der Aufbau und die Funktion der einzelnen Komponenten einer HPLC-Anlage beschrieben. Auf Sonderformen der HPLC wie Ionenchromatographie (IC) oder Gel-Permeations-Chromatographie (GPC) wird hier nicht eingegangen. Zum besseren Verständnis empfiehlt es sich in das Grundlegende Prinzip der Flüssigchromatographie eingelesen zu haben, hierzu empfehle ich Lemmis Artikel zur Dünnschicht Chromatographie.

1. Allgemeines
Ähnlich der Gaschromatographie handelt es sich bei der HPLC um eine Methodik zur Auftrennung komplexer Stoffgemische. Der wichtigste Unterschied zur GC ist jedoch der, dass die Analyten nicht untersetz Verdampfbar sein müssen, jene müssen sich lediglich im Eluenten lösen. Bis auf vernetzte hochmolekulare Verbindungen trifft die für alle organischen und ionischen anorganischen Verbindungen zu.
Die Auftrennung auf der Säule erfolgt nach Polarität der Analyten.

2. Funktion der einzelnen Komponenten
Schematische Darstellung einer HPLC



2.1 Eluent
Der Eluent hat die Aufgabe den Analyten durch das HPLC System zu transportieren, dabei erfährt dieser eine Retention und eluiert im (Säulen-)Eluat zur Retentionszeit. Grund hierfür ist die Konkurrenz zwischen Analyt und Eluenten um die Adsorbtionsstellen an der Stationären Phase (Adsorbtionschromatographie). Die Wahl des Eluenten bzw. das Mischungsverhältnis von zwei oder mehreren Eluenten hat neben der Wahl der stationären Phase einen signifikanten Einfluss auf das entstehende Chromatogramm.
Für gewöhnlich verwendet man frisch hergestelltes Reinstwasser mit bei Bedarf eingestelltem pH-Wert und Methanol bzw. Acetonitril in verschiedenen Mischungsverhältnissen.
Im Falle, dass NP-Säulen verwendet werden sollten werden anstelle von Wasser/MeOH bzw. ACN apolare Eluenten wie Pentan eingesetzt.

2.1.1 Viskosität
Wasser besitzt im Vergleich mit Methanol und Acetonitril die höchste Viskosität. Mischt man Wasser und Acetonitril verringert sich diese mit steigendem Anteil an Acetonitril, bei Methanol hingegen steigt die Viskosität über die von reinem Wasser an bis sie bei einem Volumenverhältnis von 50% ihr Maximum erreicht, bevor sie wieder abfällt. Aufgrund dieser Anomalie muss unter Berücksichtigung der Druckresistenz der Säule, der optimalen Fließgeschwindigkeit und den kosten für die Lösemittel abgewogen werden welche Lösemittelmatrix die geeignetste ist.

2.1.2 Qualität der Eluenten
Die benötigte Qualität hängt hauptsächlich davon ab welche Ziele erreicht werden sollen. Allgemein lässt sich sagen, dass je geringer Nachweis/Bestimmungsgrenzen seien sollen umso höher sind die Anforderungen an die Eluenten. Probleme die bei Lösemitteln mit unzureichender Qualität auftreten können sind ein verschlechtertes Signal-Rausch-Verhältnis, Geister Peaks bis hin zur irreversible Verunreinigung der Säule.
Unabhängig davon müssen die Eluenten jedoch Partikel frei seien um ein verstopfen der Säule zu verhindern.

2.2 (Online-)Degaser
Dieser hat die Aufgabe die mobile Phase von gelösten Gasen zu befreien um das Entstehen von Gasblasen zu verhindern. Gelängen diese nämlich in die Pumpe würden sie einen gleichmäßigen Fluss unmöglich machen. Obendrein belasten jene Schwankungen die Säulenpackung was zur Verringerung der Lebendsauer der Säule führen kann. Ebenso besteht am Ende der Säule aufgrund des starken Druckabfalls die Gefahr von Blasenbildung. Von dort können diese dann in den Detektor wandern wo sie ein Drift der Basislinie, vermehrtes Rauschen oder sogar ungewollte Peaks verursachen können. Zur Entfernung des gelösten Gases werden die Eluenten durch einen Schlauch der aus einer semipermeablen Membran besteht, durch eine Vakuumkammer geleitet. Aufgrund des reduzierten Umgebungsdruck wird das gelöste Gas aus dem Eluenten entfernt. Gegebenenfalls ist es notwendig die Eluenten im Vorfeld im Ultraschallbad vor zu behandeln; ein alleiniges „degasen“ mittels Ultraschallbad ist auf Grund der relativ hohen im Eluenten verbleibenden Gasmenge keine geeignete Möglichkeit um eben diese zu entfernen.

2.3 Pumpe
Bei HPLC Pumpen handelt es sich um Kuzhubkolbenpumpen welche die Aufgabe haben den Eluenten mit gleichbleibendem Fluss durch das System zu fördern. Da beim Ansaugvorgang die Förderung des Eluenten unterbrochen wird, verwendet man eine zweite Pumpe die Phasenverschoben arbeitet. Dabei können in Abhängigkeit zur Viskosität und Volumenstrom des Eluenten sowie der Porengröße der Säulenpackung drücke von 400 bar (1000 bar bei UHPLC) erreicht werden. Hingegen eines weit verbreiteten Irrglaubens trägt der Druck nicht zur Trennung bei, ehr ist dieser als ein notwendiges Übel an zu sehen. Üblich sind Fließgeschwindigkeiten von 0,5 – 2 mL/min. Um das umstellen auf ein anderes Eluentensystem zu beschleunigen befindet sich zwischen Pumpe und Säule ein Ventil (Purgeventil). Dieses stellt einen Bypass dar welcher dafür sorgt, dass der Eluent direkt in das Abfallgefäß fließt. So können wesentlich höhere Flüsse (~ 5 mL/min) gefahren werden.
Die Pumpe sollte nie ohne Eluent betrieben werden, da dieser gleichzeitig als Schmier- und Kühlmittel fungiert. In Abwesenheit des Eluenten kommt es dadurch zu verstärkter Abnutzung des Kolbens und der Laufbahn welche schlussendlich in einer Undichtigkeit und somit zu Druckverlust führt.
Die Niederdruckleitungen bestehen meist aus PTFE, die Hochdruckleitungen aus gezogenen Edelstahlkapillaren.

2.3.1Gradientensysteme
Die Zusammensetzung des Eluenten beeinflusst die Analyten welche aufgetrennt werden können und die Zeit welche es brauch um diese von der Säule zu eluieren. Bei einer Isokratischer Elution (d.h. gleichbleibender Zusammensetzung des Eluenten) der Probe werden die wenig retadierten Komponenten früh und stark gedrängt erscheinen, während die stärker retardierten Analyten aufgrund von Diffusion breite, späte Peaks liefern.
Dieses Problem kann durch die Verwendung eines Gradientensystems beseitigt werden. Hierzu wir im Laufe der Analyse die Zusammensetzung des Eluenten verändert (von Polar nach unpolar).
Man unterscheidet zwischen Hoch- und Niederdruckgradienten d.h. Mischung der Eluenten Komponenten vor bzw. nach der Pumpe.

2.4 Probenaufgabe
Hier unterscheidet man zwischen der Injektion über ein Septum mittels Hochdruckspritze und der Probenaufgabe via Mehrwegeventils/ Probenschleife.
Die Probenaufgabe über ein Septum hat den Vorteil, dass man ohne Bauteile wechseln zu müssen das Probenvolumen variieren kann (in Abhängigkeit der verbauten/vorhandenen Spritze). Dieser Vorteil kommt aber gerade bei der manuellen Injektion zur Lasten der Reproduzierbarkeit, weswegen diese Art der Probenaufgabe Hauptsächlich bei Autosamplern genutzt wird.
Bei manuellen Injektionen wird die Probenschleife bevorzugt, da diese eine bestmögliche Reproduzierbarkeit garantiert. Dabei wird mit Hilfe einer Spritze, welche mit Spritzenvorfilter und einer stumpfen Kanüle ausgestattet ist, die Probe in das Ventil injiziert. Man spritzt so viel ein, dass die Probenschleife ausreichend mit Probe gespült wird d.h. Probenlösung aus dem Wastgae herausläuft. Nun stellt man das Ventil von der Position „load“ auf „inject“ um, so dass die Probenschleife vom Eluenten durchspült wird, erst jetzt entfernt man die Spritze aus der Vorrichtung. Mit dem umlegen des Ventiles startet in der Regel automatisch die Analysensequenz. Die Probenschleifen sind auswechselbar so das sie je nach Anforderung an das System ausgetauscht werden kann, erhältlich sind diese typischerweise in Volumina von 1 – 50 µL, wobei 20 µL mit Abstand die geläufigste Größe ist.



2.5 Säule
Hauptsächlich verwendet man RP-Säulen (RP = reversed phase) bei diesen sind die an der Oberfläche befindlichen Silanol-Gruppen der porösen Kieselgelpackung mit verschiedenen Alkyl- oder Arylsilanen funktionalisiert, die am weitesten verbreitete Packung ist jedoch C18 modifiziert. Da je nach Raumforderung der eingeführten Kette (Steirischer Hinderung) nicht jede Silanol-Gruppe substituiert werden kann, werden die verbleibenden je nach Bedarf in einem zweiten Schritt mit Trimethylchlorsilan umgesetzt um die Polarität noch einmal weiter herab zu setzen. Dieses Verfahren nennt sich „end-capping“. Seltener verwendet werden NP- Säulen (NP = normal pase), diese Säulen sind mit Kieselgel bzw. Aluminiumoxid gefüllt. Weiter gibt es für die Trennung chiraler Stoffgemische Säulenpackungen welche z.B. mit enantiomerenreinen Aminosäuren funktionalisiert sind und so durch Bildung von Diastereomeren eine Trennung ermöglichen.
Zu extreme pH-Werte sollten vermieden werden, da unter diesen Bedingungen die Alkyl-, Arylsilane durch Hydrolyse abgespalten werden. Genaue Angaben zur pH und Druckstabilität einer Säule finden sich im entsprechenden Datenblatt. Üblich sind jedoch pH Bereichen vom 2-8, spezielle Säulen Füllungen können aber auch bis pH 1 bzw. bis weit ins basische stabil sein.
Häufig verwendete Säulendimensionen sind 50 – 150 mm (bei hoch komplexen Trennproblemen auch bis 300 mm) Länge bei 2 – 4,6 mm Innendurchmesser mit Korngrößen zwischen 3 – 10 µm, bei UHPLC Säulen sind Partikelgrößen von 1,3 µm möglich. Um die Hauptsäule vor Verschmutzung zu schützen kann man zusätzlich zu Inlinefiltern und Spritzenvorfiltern bei manueller Injektion Vorsäulen verwenden. Dabei handelt es sich um eine vergleichsweise günstige Mini-Säule von gleicher Art wie die Hauptsäule die vor die eigentliche Trennsäule geschaltet wird um also „Opfersäule“ zu dienen.
Ein trocken laufen der Säule ist unbedingt zu verhindern, da durch das eintrocknen Unregelmäßigkeiten in der Packung entstehen können welche einen gleichmäßigen Fluss und somit eine optimale Trennung verhindern. Des Weiteren ist das entlüften der Säule eine Zeitraubende Prozedur.
Soll die Säule eingelagert werden so sollte diese einen Eluenten beinhalten der zu mindestens 50% aus organischem Anteil besteht um die Vermehrung von Mikroorganismen zu verhindern. Pufferhaltige Eluenten müssen zuvor mit Wasser ausgespült werden um ein ausfallen der Salze zu verhindern. Weiter ist es wichtig, dass die Enden der Säule gut verschlossen werden um ein Austrocken zu vermeiden. Genauere Säule spezifische Angaben finden sich im Entsprechenden Datenblatt.

2.6 Säulenofen
Dieser hat die Aufgabe die Säule bei einer konstanten Temperatur zu halten. Im Gegensatz zur Gaschromatographie werden keine Temperaturprogramme gefahren. Auch lässt sich sagen, dass die Temperatur Optimierung in der LC keinen derart wichtigen Standpunkt einnimmt. Der wohl wichtigste Gesichtspunkt der Temperaturkontrolle spielt wohl die Erniedrigung der Viskosität des Eluenten und die damit einher gehende Verringerung des benötigten Systemdrucks.

2.7 Detektoren
Mit Hilfe des Detektors wird der von der Säule eluierende Analyt detektiert. Nachfolgend wird kurz auf das Funktionsprinzip der geläufigsten Detektoren eingegangen

2.7.1 DAD (Dioden-Array Detecotr)
Der Dioden-Array-Detektor misst die Licht-Absorption des Eluats. Das Eluat fließt durch eine Durchflussküvette, diese wird mit polychromatischem Licht (UV/VIS) durchstrahlt. An einem Beugungsgitter wird das transmittierte Licht in die verschiedenen Wellenlängen zerlegt. Diese werden nun auf nebeneinander angebrachten kleinen Fotozellen dem Dioden-Array projiziert; welche die Strahlungsintensitäten erfassen und als Spannungssignal an einen Computer weiter leiten. Dieser errechnet aus den Transmissionswerten die Extinktion welche in Abhängigkeit zur Zeit das Chromatogramm ergibt. Da hier mehrere Wellenlängen gleichzeitig gemessen werden entsteht ein dreidimensionales Chromatogramm.
Dies hat den Vorteil, dass anhand der Stoff spezifischen Absorption des polychromatischen Lichtes darauf rückgeschlossen werden kann ob die Verbindung mit einer anderen koeluiert.



2.7.2 Fluoreszenzdetektor
Der Fluoreszenzdetektor spricht selektiv auf Analyten an die zur Fluoreszenz angeregt werden können, wobei er zwei bis drei Zehnerpotenzen empfindlicher ist als der DAD.
Die erhöhte Sensibilität beruht auf der Tatsache, dass keine Intensitätsdifferenz, sondern eine Licht Emission gemessen wird. Solange kein Fluorophor vorliegt ist das Detektorsignal gleich null.



2.7.3 RI Detektor (Refractive Index = Brechungsindex)
Beim Brechungsindex Detektor handelt es sich um einen universell nutzbaren Detektor. Er ist in der Lage alle Analyten die sich im Brechungsindex vom Eluenten unterscheiden zu detektieren. Aufgrund des Messprinzips kann kein Gradient gefahren werden. Schwankende Temperaturen beeinflussen diesen Detektor sehr stark.
Durch beiden Zellen (Mess- und Referenzzelle) wird der Lichtstrahl der Lampe so gelenkt, dass er auf eine Photozelle trifft, nachdem er das Prisma verlassen hat. Ändert sich der Brechungsindex des Eluates, so ändert sich der Widerstand der Photozelle in der Meßzelle da dieser nun nichtmehr vollständig auf die Photozelle scheint. Der Spannungsunterschied der Photowiderstände beider Zellen gibt ein elektrisches Signal welches als Peak dargestellt wird.
Aufgrund der geringeren Empfindlichkeit wir dieser Detektor lediglich eingesetzt wenn der Analyt weder zur Fluoreszenz angeregt werden kann oder Licht im UV/VIS Bereich Absorbiert. Dazu zählen zum Beispiel: Zucker oder Kohlenhydrate



2.7.4 MS / MS-MS (Massenspektrometer / MS-MS Kopplung)
Im Massenspektrometer werden die Analyten in Analytionen überführt und in einem Hochvakuum nach ihrem Masse/Ladungsverhältnis (m/z) getrennt. Ein MS besteht aus einer Ionenquelle einem Massenfilter und einem Detektor.
Zur Erzeugung der Analytionen verwendet man in der LC-MS Kopplung folgende Ionenquellen:

-APCI (atmospheric pressure chemical ionization)
Das Eluat wird mit N2 fein zerstäubt in ein Ofenrohr bei bis zu 400 °C eingesprüht wobei Eluent und Analyten verdampfen. Die verdampften Bestandteile werden nun an einer Nadel vorbeigeleitet an der eine Hochspannung angelegt ist. An dieser kommt es zu einer Corona Entladung welche den Eluent Ionisiert. Durch Stoßübertragung wird diese Ladung an den Analyten überträgt. Die entstandenen Quasimolekülionen und Fragmentionen werden zur Trennung und Analyse in das Massenspektrometer geleitet. Dazu werden sie fokussiert und stufenweise über verschiedene Kammer in das im MS anliegende Vakuum eingebracht.
Die APCI eignet sich besonders für schlecht ionisierbare / gering funktionalisierte Analyten. Im Gegensatz zum zur ESI tritt bei der APCI aufgrund der hohen Temperatur eine leichte Fragmentierung auf. Das Quasimolekülionen liegt als [M+H]+ oder [M-H]- vor. Das heißt ein Analyt mit der Masse von 163u wird als Quasimolekülion in der Form [M+H]+ im Massenspetrum als ein Peak mit dem Ladngsverhältnis m/z von 164 angezeigt. Kationen- bzw. Anionenaddukte sind aufgrund des separat abgetrennten Eluenten ehr selten.



-ESI (Elektrospray-Ionisation)
Bei der Elektronensray-Ionisation wir eine Hochspannung von 2-5 kV an die Kapillare angelegt aus das Eluat austritt. Je nach Messmodus dient diese als Anode bzw. als Kathode. Wird diese als Anode geschaltet bilden sich Quasimolekülionen mit positiver Ladung aus, dieser Modus ist der universellere da sich die Mehrzahl der Analyt Moleküle protonieren lässt. Eine Messung im negativen Modus hingegen ist wesentlich selektiver da nur Analytmoleküle die zur Deprotonierung neigen Ionisiert werden z.B. Carbonsäuren.
Durch die angelegte Hochspannung bildet sich der sogenannte Taylorcone aus, aus welchem kleine Eluattröpfchen heraus platzen. Diese werden in einem mäßigen Strom aus Stickstoff immer weiter eingeengt bis die Rayleigh Grenze erreicht ist.
Nun kommt es entweder zu einer sogenannte Coulombexplosion welche die großen Tröpfchen aufgrund der hohen Konzentration gleichnamiger Ladung in mehrere kleinere zerreißt, welche weiter eingeengt werden bis schließlich nur noch die freien Quasimolekülionen vorhanden sind. Oder die Quasimolekülionen werden aus den geladenen Tröpfchen heraus geschleudert, dieses kann auf Grund der unterschrittenen Rayleigh Grenze nun weiter eingeengt werden, dies wiederholt sich bis ebenfalls bis nur noch Quasimolekülionen vorliegen. Nach welchem Mechanismus es genau abläuft ist nicht abschließend geklärt.
Die Quasimolekülionen gelangen durch den Cone/Skimmer in die nächste Stufe, hier werden sie unter verringertem Druck mit Hilfe des declustering Potential in Richtung der so genannten Orifice-Plate beschleunig wodurch es zu Kollisionen zwischen den Quasimolekülionen kommt. Dieser Schritt dient in erster Linie dazu noch vorhandene Lösemittelreste welche mit den Quasimolekülionen ein Cluster gebildet haben zu entfernen um so die Ausbeute an verwertbaren Ionen zu erhöhen. Jedoch kann man durch Erhöhung der angelegten Spannung auch eine Stoßinduzierte Fragmentierung erzwingen (CID: Collision induced dissociation; CAD: collisionally activated dissociation). Von hier aus werden die Ionen weiter fokussiert und über weitere Kammern mit immer niedrigerem Druck in den Massenanalysator überführt.
Die Quasimolekülionen liegen hier als [M+nH]n+, [M-nH]n- oder aufgrund von Matrix Effekten als Kationenaddukt [M+X]+ (X= K+, Na+, NH4+) bzw. als Anionenaddukt [M+A]- (A = Cl-, ...) vor.



Massenfilter
Der bzw. die Massenfilter haben die Aufgabe die entstandenen Ionen nach ihrem Masse-Ladungs-Verhältnis zu trennen. Hierzu die gängigsten Massenfilter Beziehungsweise deren Kopplung:

Quadrupol MS(QMS)
Im Quadrupol werden die Ionen durch ein Variables elektrisches Feld zwischen zwei Elektrodenpaaren auf eine oszillierende Trajektorie gelenkt. Nur Ionen mit dem „richtigen“ Verhältnis m/z werden auf einer stabilen Trajektorie durch den Massenfilter geleitet. Zu schwere oder leichte Ionen kollidieren mit den Elektroden und werden als Molekül über das Vakuum entfernt. Dies wird erreicht in dem an den Elektroden simultan ein Gleichstrom und eine hochfrequenter Wechselstrom angelegt wird. Durch Variation der angelegten Potentiale ist es so möglich innerhalb weniger Millisekunden einen großen Bereich verschiedener Masse-Ladungs-Verhältnisse mit dem Quadrupol zu filtrieren und an den Detektor weiter zu leiten.
Hier gibt es nun die Möglichkeit einzelne Massen aus zu wählen (SIM, selected ion monitoring) oder über einen gewissen Bereich alle Massen zu scannen (scan).



Triple Quadrupol MS (TQ-MS)
Hier werden drei Quadrupole in Reihe geschaltet, dabei übernehmen Q1 und Q3 die Funktion des Massenfilters während q2 als Kollisionszelle dient und durch CID eine Fragmentierung hervorruft. Hieraus ergeben sich mehrere verschiedene Möglichkeiten für Messmodi mit dem TQ-MS. Diese MS-MS Kopplung wird bevorzugt für die Quantifizierung von Analyten eingesetzt, eine Qualifizierung ist ebenfalls möglich jedoch bieten MSn (Iontrap) und QqTOF (Quadrupol time-of-flight) im Vergleich dazu aufgrund ihrer Konstruktion höher auflösende Scanmodi.

-Single MS
Lediglich ein Massenfilter ist aktiv.

-Produktionen Scan
Q1 lässt nur ein gewünschtes Ion passieren z.B. [M+H]+, In q2 wird dieses fragmentiert und Q3 scannt alle Fragmentionen.
Dieser Modus ist zur Identifikation von Substanzen in schwierigen Matrizes da alle störenden Ionen von Q1 ausgeblendet werden.

-Precuserionen Scan
Q3 lässt nur ein gewünschtes Fragmention hindurch
Dann wird das Ion zugeordnet, das von in diesem Moment von Q1 durchgelassen und in q2 fragmentiert wurde.
Ideal, wenn man ein bestimmtes Fragmention sucht, das Mutterion jedoch nicht kennt. Beispielsweise beim Aufspüren von Metaboliten.

-Neutralloss Scan
Q1 lässt nur ein gewisses Ion hindurch welches in q2 fragmentiert wir, Q3 lässt nur Ionen hindurch die eine gewisse Neutralabspaltung erfahren haben z.B. 286 u → 266 u (Q1: 284 u / q2 -18u / Q3: 266 u)
Ideal wenn man nach bestimmten Substanzgruppen sucht welche typische Neutralabspaltungen aufweisen.
-Alkohole (18 u = Wasser)
-Carbonsäuren (44 u = CO2)

-Multible Reaction Monitoring (MRM)
Q1 lässt nur ein gewünschtes (precusor-)Ion durch z.B. [M+H]+ welches in q2 fragmentiert wird. Q3 lässt wieder nur speziell ausgewählte Fragmentionen hindurch
Bei dieser Methode erzielt man die höchste Selektivität, das höchstes s/n-verhältnis und die höchste Empfindlichkeit

Quadrupol Time of Flight MS (QqTOF-MS)
Q1 und q2 übernehmen dieselben gleichen wie bei TQ-MS, jedoch ist das Flufgzeitmassenspektrometer kein Massenfilter ist d.h. es werden immer alle Ionen (nacheinander von „schwer“ nach „leicht“) erfasst, ein SIM Modus steht hier nicht zur Auswahl. Durch erhöht sich das s/n-Verhältnis und die mögliche Auflösung signifikant. Das Gerät bestimmt das Verhältnis von m/z durch die Ermittlung der Flugzeit. Hierzu werden die Ionen in einem elektrischen Feld beschleunigt an einer Optik reflektiert und auf den Detektor geleitet.



Iontrap (MSn)
Hier kann man zwischen der Paul-Falle und der Penning-Falle unterscheiden.
Die Paul-falle nutzt ähnlich dem Quadropol zeitlich veränderliche elektromagnetische Felder um die Ionen ganzheitlich bzw. selektiv ein zu fangen und zu halten während die Penning-Falle eine Kombination aus zeitlich konstanten magnet und elektrischen Feldern nutzt. Anwendung in der analytischen Chemie findet jedoch hauptsächlich die Paul-Falle.
Dadurch, dass die Ionenfalle beliebige Ionen durch gezielte Manipulation der elektromagnetischen Felder zurück halten und diese durch CID fragmentieren kann spricht man auch von MSn da hier beliebig oft die Fragmentierung und Selektion entsprechender Fragmentionen wiederholt werden kann.

Detektor
Zur Detektion der Aufgetrennten Ionen werden Sekundärelektronenvervielfacher wie der Kanalelektronenvervielfacher eingesetzt. Diese Technik erlaubt es durch Sekundärelektronenemission im Vakuum geringe Eingangssignale zu verstärken so dass die Verstärkung einen Faktor in der Größenordnung von 108 erreicht.
Der Grundkörper des Kanalelektronenvervielfachers besteht aus einem Isolator der mit einer hochohmigen Beschichtung versehen (109Ω) ist an welche eine Hochspannung im Bereich von 2 kV angelegt ist. Trifft nun das Primärteilchen auf die Beschichtung so schlägt dieses Elektronen aus ihr heraus welche wiederum beschleunigt werden und weitere Elektronen herausschlagen bis am Ende ein messbarer Strom entsteht.




Bildquellen:
Ventilpos A/B: http://www.vici.com/support/app/app11j.php am 27.08.2016
DAD: http://www.chemgapedia.de/vsengine/media/vsc/de/ch/3/anc/croma/hplc/detektoren/diodenarray/dagr1102.gif am 27.08.2016
Fluoreszensdetektor: http://www.chemgapedia.de/vsengine/media/vsc/de/ch/3/anc/croma/hplc/detektoren/fluoresz/fluoreszenz1gr1102.gif am 27.08.2016
APCI: http://www.particlesciences.com/images/tb/apci-ion-source.jpg am 29.08.2016
RI Detektor: http://www.umweltlabor.de/Labor/Im19.gif am 11.09.2016
ESI: http://www.specmetcrime.com/ESIoni8.gif am 11.09.2016
TOF: https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/1/1e/TOF-reflectron.png am 13.09.2016
Quadrupol: http://www.vias.org/tmanalytik_germ/img/er_abb165.png am 13.09.2016
SEV: https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/6/67/Electron_multiplier.svg/509px-Electron_multiplier.svg.png am 13.09.2016
schema: http://www.mpip-mainz.mpg.de/3483799/HPLC_Schema_800x330_96dpi.png am 14.09.2016
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Die versprochene Methodenentwicklung und die dazugehörigen chromatografischen Kennzahlen würde ich der Übersicht halber in einem separaten Artikl posten.
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Prima, jetzt habe ich endlich auch als Laie Prinzip und Funktionsweise endlich verstanden!

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Vielen Dank!

Ich finde den MS-Teil super. Das ham wir in der Schule zwar mal angesprochen, aber hauptsächlich die Auswertung und die Technik bei weitem nicht so genau!

Liebe Grüße,
Florian

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Gefällt mir erstmal sehr gut. Eine gute Ergänzung wäre es noch, wenn du auch auf multidimensionale LC, so wie auf µLC und nanoLC eingehen könntest. Diese Methoden spielen eine immer wichtigere Rolle und würden den Artikel gut abrunden.
Vielleicht könntest du auch noch was zur Datenauswertung bei der Quantifizierung was sagen. Vielleicht auch etwas zur Molekülidentifikation, Verwendung von NIST und Probleme bei der Trennung der Analyten.

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Danke für das Lob bis hier hin.
Ein Abscnitt über die 2D LC wäre in der Tat ein sinnvolle Ergänzung, zum Thema Miniaturisierung werd ich auchnochmal nen kleinen Abschnitt verfassen.
Zu den Themen: Inbetriebnahme, Methodenentwicklung/optimierung, Fehler/Probleme bei der Trennung plus den chromatografischen Kennzahlen hätt ich der Übersicht zur liebe einen getrennten Artikel geschrieben. Wenn das allerdings nicht gewünscht ich kann ich diesen, wenn er so weit ist, auch gern hier einfügen.
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Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC)
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