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Hämoglobin (AHD-575-Methode)
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Bestimmung von Hämoglobin nach der AHD-575-Methode

Für die Bestimmung von Hämoglobin, einem der wichtigsten klinisch-chemischen Parameter, gibt es mehrere Methoden. Lange Zeit war die Cyanmethämoglobinmethode (HiCN) Standard. Hier wird die AHD-575-Methode dargestellt, die gegenüber der älteren HiCN-Methode mehrere Vorteile hat. Die Abkürzung steht für Alkaline Hemin Detergent und die Zahl 575 gibt die Wellenlänge an, bei der die Extinktion gemessen wird.


Geräte:

Messkolben 5 ml und 100 ml, Vollpipette 10 ml, Messpipette 5 ml, Kolbenhubpipetten 1000 µl und 20 µl, Analysenwaage, Reagenzgläser, Photometerküvetten (1 cm Schichtdicke), Photometer


Chemikalien:

Häminchlorid (Hämin B)

Natronlauge 1 N (C)


Triton X-100 (Sigma) (N, Xn)



Analysengut:
Blutproben (B)



Hinweis:

Blutproben müssen wegen des biologischen Risikos mit Handschuhen gehandhabt werden!


Durchführung:

Das AHD-575-Reagenz wird folgendermaßen hergestellt: Man legt etwas Wasser im 100 ml-Messkolben vor, wiegt 1 g Triton-X 100 ein und lässt unter häufigem Schwenken einige Stunden stehen, bis sich das sirupöse Detergens zu einer klaren Flüssigkeit gelöst hat. Umschütteln ist zu vermeiden, da sonst eine starke Schaumbildung eintritt! Dann gibt man 10 ml 1 N Natronlauge zu und füllt mit dest. Wasser auf 100 ml auf.

Die Proben werden zur Messung im Verhältnis 1 + 150 (1:151) verdünnt. Dazu befüllt man Reagenzgläser mit Hilfe einer Messpipette mit genau 3 ml der Reagenzflüssigkeit und gibt mit einer Kolbenhubpipette 20 µl Blut zu. Das Röhrchen mit der Blutprobe muss zuvor 20 mal gekippt werden, um den Inhalt gut zu durchmischen, denn die Erythrozyten setzen sich beim Stehen des Röhrchens ziemlich rasch ab. Nach kurzem Stehen (etwa 2-3 Minuten) ist die Mischung vollkommen transparent und hat eine olivgrüne Farbe.

Die Messung wird in einem Photometer bei der Wellenlänge 575 nm vorgenommen. Da ich kein Spektralphotometer, sondern nur ein Filterphotometer besitze, habe ich bei 578 nm gemessen und musste dazu eine eigene Eichkurve erstellen (siehe weiter unten). Zunächst muss die Quecksilberdampflampe etwa 20 Minuten einbrennen. Dann bringt man eine Küvette mit reinem Reagenz in den Strahlengang und justiert bei geschlossenem Lichtweg auf E = „Unendlich“ sowie bei offenem Lichtweg auf E = 0. Schließlich ersetzt man die Küvette durch eine mit der zu untersuchenden Probenverdünnung befüllte und liest die Extinktion ab.

Als Kalibrator dient eine Lösung von reinem Häminchlorid. Man löst 50,0 mg davon in 8-9 ml AHD-575-Reagenz und füllt die tiefbraune Lösung auf genau 10,0 ml auf. Diese Lösung entspricht einer Blutprobe mit einem Hämoglobingehalt von 123,7 g/l und wird wie eine solche zu 20 µl auf 3 ml AHD-575-Reagenz verdünnt und gemessen. Der Standard ist nicht stabil und muss sofort (binnen einiger Stunden) verwendet werden!

Ich habe die Standardprobe dann in drei Stufen jeweils 1+1 mit frischem Reagenz verdünnt und die Extinktionen gemessen. Erhalten habe ich folgende Messwerte:

Standardlösung E = 0,322
Verdünnung 1:2 E = 0,165
Verdünnung 1:4 E = 0,088
Verdünnung 1:8 E = 0,044

Aus der graphischen Darstellung („ocular-fit" Kurve) ergibt sich ein Faktor von 374,5 zur Umrechnung der Extinktion in Hämoglobin [g/l].

Ich habe mehrere Proben mit dieser Methode gemessen und parallel an einem automatischen Blutbildgerät bestimmen lassen. Die Ergebnisse waren (erster Wert selbst gemessen, zweiter Wert auswärtiges Labor):

Probe 1: 122 gl vs. 118 g/l
Probe 2: 137 gl/ vs. 135 g/l
Probe 3: 94 gl/ vs. 97 g/l
Probe 4: 104 g/l vs 104 g/l

Wie man sieht, stimmen die Werte recht gut überein. Daß meine Werte tendenziell eher leicht über den maschinell gemessen liegen, könnte neben statistischen Schwankungen (Pipettierfehler) auch darauf beruhen, daß der Automat nach der Cyanmethämoglobinmethode arbeitet.


Entsorgung:

Die Lösungen können über das Abwasser entsorgt werden

Erklärung:

Das menschliche Hämoglobinmolekül ist ein Tetramer, das aus vier Untereinheiten besteht. Diese Untereinheiten kommen in verschiedenen Varianten vor, die sich in ihrer Aminosäuresequenz unterscheiden und dem Gesamtmolekül unterschiedliche Eigenschaften verleihen. Beim Erwachsenen dominiert Hämoglobin A1 mit etwa 97% des gesamt-Hb. Es besteht aus je zwei alpha- und zwei beta-Ketten (Kurzschreibweise α2β2). Daneben kommen kleine Mengen Hämoglobin A2 (α2δ2) und fetales Hämoglobin (Hämoglobin F, α2γ2) vor.



Die durchschnittliche Molmasse des Hämoglobin-Tetramers beträgt 64460 g/mol. Jede Untereinheit enthält als prosthetische Gruppe ein Molekül Häm gebunden. Das zur Kalibrierung eingesetzte Häminchlorid hat die Molmasse 651,95 g/mol. Daraus ergibt sich daß 40,4 mg Häminchlorid 1 g Hämoglobin (Tetramer) äquivalent sind.

Das AHD-Reagenz lysiert die Erythrozyten (das Detergens löst die lipoidhaltige Zellmembran auf) und bildet mit dem Häm des Hämoglobins einen in seiner Zusammensetzung nicht genau bekannten Komplex von olivgrüner Farbe, dessen Extinktionsmaximum bei 575 nm liegt, und der in einem weiten Konzentrationsbereich dem Lambert-Beer´schen Gesetz folgt. Der Inhaltsstoff von Triton x-100 ist Octoxinol-9, ein p-(tert)-Octyl-Phenol-Polyethylenglycol. Es handelt sich um ein nichtionisches Detergens, das Proteine nicht denaturiert (x = 9-10):



Die hier beschriebene Methode hat gegenüber der „klassischen“ Cyanmethämoglobinmethode mehrere Vorteile. Einmal ist das AHD-Reagenz – für die HiCN-Methode wird eine Kaliumcyanid-haltige Lösung verwendet – ungiftig und kann leicht selbst hergestellt werden. Die Konzentrationen der Bestandteile sind relativ unkritisch, kleine Schwankungen der Zusammensetzung fallen nicht ins Gewicht. Die Reaktion in der Probemischung läuft schnell ab (Messungen zeigten, daß sie nach 120 Sekunden vollendet ist) und die Extinktion ist über mehrere Stunden stabil. Am wichtigsten ist aber, daß die Messung mit Hilfe des Häminchlorids an einem absoluten, leicht rein erhältlichen Standard kalibriert werden kann. Für die HiCN-Methode muss dagegen ein biologischer Hämoglobinstandard verwendet werden, dessen Gehalt wiederum bestimmt werden muss. Ich habe für meine Messung bei 578 nm einen Umrechnungsfaktor von 374,5 gefunden.



Wenn bei 575 nm gemessen wird, ist laut Literatur ein Faktor von 349,6 zu verwenden.

Der normale Hämoglobingehalt des Blutes ist alters- herkunfts- und geschlechtsabhängig. Die untere Grenze (2,5-Perzentile) beträgt bei kaukasischen Männern im mittleren Lebensalter 137 g/l, bei Frauen 122 - g/l. Die WHO hat einfacherheitshalber eine Untergrenze von 120g/l für Frauen und 130 g/l für Männer definiert, die zur Diagnose einer Anämie (Blutarmut) verwendet werden soll.


Literatur:

Zander R, Lang W, Wolf U: Alkaline haematin D-575, a new tool fort he determination of haemoglobin as an alternative tot he cyanmethaemoglobin method. I. Description of the method; Clinica Chimica Acta 136 (1984): 83-93
Wolf U, Lang W, Zander R: Alkaline haematin D-575, a new tool fort he determination of haemoglobin as an alternative tot he cyanmethaemoglobin method. II. Standardisation of the method using pure chlorohaemin; Clinica Chimica Acta 136 (1984): 95-104
Zander R und Lang W: The Determination of Haemoglobin as Cyanmethaemoglobin or al aklaine Haematin D-575 – Comparision of Method-Related Erros; Journal of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry 27 (1989):185-189
Heuck CC, Reinauer H, Wood WG: The Alkaline Haematin Detergent (AHD575) Method for the Determination of Haemoglobin in Blood – a Candidate Reference Measurement Procedure; Clinical Laboratroy 54 (2008): 255-272


Danksagung: Danke an Cyanwasserstoff für die Bereitstellung des Hämin-Standards!


Bilder:


Ansetzen des AHD-575-Reagenzes


Verdünnung der Blutprobe


Hämin-Standard


Das von mir verwendete Photometer


Extinktion 0,325

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Sehr schöner und informativer Artikel. Ein klassischer lemmi Very Happy Es freut mich, dass wir wieder Zuwachs in der Biochemie Abteilung bekommen.
Vielleicht könntest du auch einmal einen Artikel zur Blutgruppenbestimmung nach dem AB0-System schreiben ?

Übrigens, wir haben für biologische Proben vor einiger Zeit das nachfolgende Symbol B (hazard=b) eingeführt:

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frankie hat Folgendes geschrieben:
Übrigens, wir haben für biologische Proben vor einiger Zeit das nachfolgende Symbol B (hazard=b) eingeführt:


Danke! Mir fehlt hier irgendwo eine Liste der Symbole. Ich kann mir die ganzen Abkürzungen nämlich nicht merken.
Und wie hast du die griechischen Buchstaben in den Text eingefügt ? (Das warst doch Du, oder?)

Die Blutgruppenbestimmung habe ich bislang nur mit Testkarten gemacht - finde ich nicht so spannend, ehrlich gesagt Cool

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Ja ja, das hab ich mir erlaubt Smile

Zu deiner Frage:


Es gibt die Gefahrensymbole: B, C, E, F, F+, Laser, HV, N, O, R, T, T+, Xn und Xi

lemmi hat Folgendes geschrieben:
Die Blutgruppenbestimmung habe ich bislang nur mit Testkarten gemacht - finde ich nicht so spannend, ehrlich gesagt Cool

Kann man den Rhesus-Faktor auch mittels Karte bestimmen ? Na gut, dann vielleicht ein großes Blutbild oder so Mr. Green

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frankie hat Folgendes geschrieben:
Kann man den Rhesus-Faktor auch mittels Karte bestimmen ? Na gut, dann vielleicht ein großes Blutbild oder so Mr. Green


Das mit dem Rhesus-Faktor ist etwas komplizierter, geht aber prinzipiell auch mit einem Testserum auf der Karte. Hinter dem Rhesus-Faktor verbergen sich 5 Antigene, nämlich C, c, D, E und e, die man einzeln bestimmen kann. Von diesen ist D das klinisch wichtigste und die Bezeichnung "Rh-" bezieht sich auf "D-Abwesend". Die Rhesusformel kann also cc-Ee oder auch cC-EE lauten oder ähnlich. Man spricht daher heute oft von "D-negativ" statt "Rhesus-negativ". Darüber hinaus gibt es übrigens noch jede Menge andere Erythrozyten-antigene, so das Kell-Antigen, das Duffy-Antigen oder die Antigene I und i, die bei autoimmunen Anämien eine Rolle spielen, im ganzen mindestens 50, von denen fast alle klinisch nur sehr selten relevant sind.

Das große Blutbild ist eine Leidenschaft von mir! Greife ich vielleicht mal auf, wenn es hier reinpasst - hat dann aber mit (Bio-)Chemie nur noch am Rande zu tun. Wink

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Schick... gefällt mir - wir immer! Smile

Hätte noch Hämiglobincyanid da Wink

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Gefällt mir! Very Happy Schön dass das Hämin noch eine weitere Anwendung gefunden hat.

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Sehr schön erläutert und wie immer hervorragend dokumentiert! So macht es mir Freude, auch andere Wissenschaft-Bereiche in diesem Fall "theoretisch" zu erkunden....

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Danke für das Lob!

@NI2: in welcher Form hast du denn das Hämiglobincyanid? Soviel ich weiß waren das immer Ampullen mit flüssigem Inhalt einer standartisierten Konzentration.

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In genau der von dir beschriebenen Smile

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NI2 hat Folgendes geschrieben:
In genau der von dir beschriebenen Smile


O.k.! ... und das Haltbarkeitsdatum ist seit wann überschritten? Wink

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NI2
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Für zwecke als photometrische Referenz zu lange Mr. Green

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