SSL (?): an | aus

Bitte die Forenregeln und die Hinweise zu den Versuchen lesen!

Neue Antwort erstellen
Fluoreszenz markiertes Polyfructosan
IllumiNobel-Gewinner 2012

Anmeldedatum: 08.05.2011
Beiträge: 807
Artikel: 4
Geschlecht: Geschlecht:Männlich
Polyfructosane wie Inulin werden eingesetzt um die sogenannte Glomeruläre Filtrationsrate (GFR) zu bestimmen vgl. http://de.wikipedia.org/wiki/Glomeruläre_Filtrationsrate
Diese Bestimmungen sind recht aufwändig und kommerziell als Inutest erhältlich. Um das Verfahren zu vereinfachen wurde Inulin mit FITC (Fluoresceinisothiocyanat) gekoppelt. FITC-Inulin hat allerdings den Nachteil, dass es vor der Anwendung dialysiert werden muss um ungebundenes FITC zu entfernen vgl. https://staging.mc.vanderbilt.edu/mkpdc/index.php?page_id=136&prot=1


Kurzfassung der Synthesen:


Es wurden zwei Synthesen gefahren (Bilder aus den beiden Synthesen).



A-Synthese:
500 mg des Polyfructosans wurden in 17 ml wasserfreiem DMF unter Stickstoff suspendiert und 15 min auf 40 bis 43°C erwärmt. Nach dem Abkühlen mittels Eisbads auf 0°C wurden 500 mg 60% NaH Suspension in Mineralöl hinzu gegeben und 5 min bei RT gerührt. Danach wurde auf 40-45 °C erwärmt und weitere 30 min gerührt. Danach wurden 350 mg FITC zugegeben und 18 h bei der gleichen Temperatur weiter gerührt.

Beobachtungen:
Suspension des Polyfructosans im DMF bleibt nach 15 min rühren bei 40 bis 43°C erhalten. Bei der Zugabe des NaH färbt sich das DMF weißlich. Bei nachfolgendem rühren wird das DMF immer mehr viskos. Sobald das FITC zugegeben wird, verflüssigt sich die Reaktionsmischung wieder.
Die Anfangs orange Reaktionsmischung verfärbt sich nach den 18 h in Richtung rot.

Aufarbeitung: Zugabe von 10 ml einer 7% Ammoniumchloridlösung gefolgt von 20 ml Wasser und 2maliges ausschütteln mit 50 ml Diethylether, wobei der Ether farblos blieb.



Die orange Lösung wurde im Roti eingeengt (Wasserbad 40°C) und anschließend noch ca. 1.5 h mit einer Edwards Two Stage Vakuumpumpe #18 getrocknet. Der Rückstand wurde in 30 ml 1:1 EtOH/Wasser aufgenommen und mittels Zugabe von 600 ml 99.99% Ethanol gefällt und abgenutscht, was sehr lange dauerte.
Filterkuchen nochmals in 30 ml 50% EtOH gelöst und in 600 ml Aceton getropft......was eine kolloidale gelbe Lösung ergab. Test mit einer kleinen Eppendorf-Zentrifuge ergab bei 16000 g (ca. 13200 rpm) ein Pellet. Versuch die Lösung aufgeteilt in 50 ml Falcons mit 3200 rpm zu zentrifugieren schlug fehl, daher die Mischung nochmals komplett eingedampft und wieder in 50% EtOH aufgenommen. Diese Lösung nun vorgelegt (mit Eiswasser gekühlt) und langsam das Aceton zugetropft, was sofort zu einer Trübung führte, so dass die Lösung wie eine orange Milch aussah; anscheinend macht die Reihenfolge doch oft einen kleinen Unterschied........

Erlenmeyer über Nacht stehen gelassen um den Ndg. zu sedimentieren. Ndg. ist zu fein zum filtrieren, daher konnte er nur abzentrifugiert werden.

Auffreinigungsversuch mit P-2 Biogel von BioRad:

Gel in Wasser quellen lassen, in eine Säule gefüllt und nur ein Teil des Produktes als Lsg. aufgetragen und mit Wasser eluiert. Da dies eine Gelfiltration ist, die ein Exclusion Limit von 100 bis 1800 units hat sollte das makierte Produkt mit dem Totvolumen der Säule eluieren. Eine orange Bande durchlief sehr rasch die Säule die gesammelt wurde, allerdings blieb das Gel danach intensiv gelb gefärbt. Versuche das Gel zu regenerieren scheiterten am Anfang: Ethanol (20%) in Wasser, 0.05 M Essigsäure versagten, erst 0.05 M Ammoniak-Lösung und zum Schluss 0.05 M Ammoniak Lösung mit 20% EtOH über Nacht führten zum Erfolg.

Die orange Bande wurde lyophilisiert und ergab die Fraktion I von der Synthese A.

Nun wurde versucht die restliche Menge der Synthese A über die Säule aufzureinigen......dabei zeigte sich, dass diesmal sich das Gel nicht bleibend gelb verfärbte sondern das Gel sich mit Wasser alleine komplett regenerieren ließ. Fraktionen Ia, II, III, IV der Synthese A.
Ein DC auf Kieselgel 60 mit 99.99% EtOH als Laufmittel zeigte, dass diesen Fraktionen noch freies FITC vorhanden war, d.h. die Trennung war nicht gelungen u.U. wurde die Säule überladen.

Daher wurden alle Fraktionen der Synthese A in 50% EtOH gelöst und gepoolt und auf Kieselgel aufgezogen, dass in eine Säule von 36 mm Durchmesser gefüllt mit 100 mm Kieselgel gegeben wurde. Die Säule wurde nass befüllt in dem eine Aufschlämmung von Kieselgel in 99.99% EtOH eingefüllt wurde und nach dem Absenken des Laufmittels wurde die Farbstoff-Kieselgel-Mischung (die in etwas 99.99%cEtOH aufgenommen wurde) auf die Säule aufgetragen. Danach wurde mit 99.99% EtOH eluiert, was dafür sorgte, dass freies FITC (was mit 20 mg/ml in EtOH löslich ist) eluiert. Nachdem das Eluant wieder klar geworden ist, wurde das Eluent gegen 50% EtOH ausgetauscht, was die Elution einer orangen Fraktion zur Folge hat:



Dabei war zu beobachten, dass dieses orange Band als Suspension aus der Säule eluierte und sich im Auffanggefäß ein Niederschlag bildete, der sich aber später auflöste, was Synthese A FI genannt wurde, beim weiteren waschen wurde eine weitere Fraktion isoliert "Synthese A FII".

Die 50% alkoholische Lösung wurde am Roti bis ins Trockene einrotiert und der Rückstand in Wasser aufgenommen, dabei zeigte sich, dass sich nicht alles löste, was darauf zurück zu führen sein dürfte, dass aus der Säule Kieselgel eluiert worden ist. Als Abhilfe wurde diese Lösung durch eine 0.45 µm PTFE-Membrane filtriert:

und anschließend lyophilisiert.



B-Synthese:

Ein Trocknungsversuch mit einer geringen Menge des Polyfructosans zeigte bei 120°C eine Gewichtsverminderung; allerdings färbte sich dabei das Produkt leicht gelblich, so dass keine Aussage zu machen ist, ob dieses Polyfructosan als Hydrat vorliegt. Trotzdem habe ich mich entschieden, es im Exikator 2 Wochen über Blaugel zu trocknen.

842 mg des Polyfructosans wurden in 29 ml DMF suspendiert und beim erwärmen auf 40/43°C und dem 15 min rühren löst sich das Polyfructosan fast komplett auf (im Gegensatz zur A-Synthese).
Abkühlen im Eisbad und Zugabe von 842 mg NaH (60% Suspension in Mineralöl) und 5 min rühren führten wieder zu einer weißlichen Lösung die allerdings im Gegensatz zu der A-Synthese beim weiteren rühren bei 40-45°C nicht mehr viskos wird und flüssig bleibt. Zugabe von 589 mg FITC führte zu einer orangen Lösung die sich nach 18 h rühren ins rote verfärbte.
Aufarbeitung wie bei der A-Synthese d.h. Zugabe von 17 ml 7% Ammoniumchlorid-Lösung und 34 ml Wasser, bis auf den kleinen Unterschied, dass zum Abtrennen des Niederschlags 500 ml PP-Becher für den Sorvall GS-3 Rotor verwendet wurden. Bei ca. 7000 rpm konnte der Ndg. sowohl aus der Alkohol- und der Acetonfällung ohne Probleme gewonnen werden.

Zur Aufreinigung wurde diesmal eine Säule mit 50 mm Druchmesser verwendet die über eine Peristaltikpumpe mit Eluant versorgt wurde. Der Niederschlag wurde auf Kieselgel aufgezogen und diese Mischung als Suspension in 99.99% EtOH auf den Säulenkopf aufgegeben, der von einer Celite-Schicht geschützt wurde, die Säule war mit 151 g Kieselgel 60 aufgeschlämmt in 99.99% EtOH gefüllt worden.

Ein erster Versuch (1. Cleaning) zeigte noch Verunreinigungen mit freiem FITC. Der Grund dafür dürfte sein, dass ich die Laufgeschwindigkeit des Eluenten zu hoch gewählt hatte. Daher wurden fast alle Fraktionen nochmals gelöst und wieder auf Kieselgel aufgezogen und nochmals einer SC unterworfen deren Ergebnisse man nun hier sieht:

Hier ein Bild der Aufgabe der Farbstoffsuspension von der Synthese B 2. Cleaning:


Einlaufen lassen und abdecken der Schicht mir einer Portion Celite. Hier ist auch schon die Elution des freien FITC zu sehen:


Aufsetzen des Stempels und Elution mit 99.99% EtOH. Im letzten Bild sind eindeutig Banden zu erkennen, zum einen ganz unter das freie FITC, was teilweise schon aus der Säule eluiert, dann eine "mittlere Bande" und oben ein gelblicher Schmier der an Ort und Stelle bleibt:


Nachdem die mittlere Bande ebenfalls eluiert war wurde der Eluant gegen 50% EtOH/Wasser ausgestauscht und das Produkt eluierte wieder als oranges Band:


Was sich als Suspension im Erlenmeyer abschied:


Der ins Trockene einrotiert wurde:


und wie beschrieben (in Wasser aufgenommen, gefiltert) von Kieselgel befreit und lyophilisiert wurde.

Hier ein DC (Kieselgel 60 F254; 20 x 20 cm; Laufmittel 99.99% EtOH) der ganzen Synthesen:

Legende:

#0: FITC Ursubstanz
#1: Synthese A FI
#2: Synthese A FII
#3: Synthese B 1. Cleaning Nachlauf
#4: Synthese B 2. Cleaning Free Dye*
#5: Synthese B 2. Cleaning Middle Fraction*
#6: Synthese B 2. Cleaning Main Fraction*
#7: Synthese B 2. Cleaning Nachlauf I*
#8: Synthese B 2. Clenaing Nachlauf II*
#9: Synthesen A/B Reste I
#10: FITC Ursubstanz

Nachläufe: Das was sich über Stunden sehr langsam aus der Säule mit 50 EtOH eluieren ließ bzw. bei #8 wurde mit Wasser die Säule komplett ausgewaschen. #9: Alles was nur irgendwie gefärbt war, wurde hier nochmals aufgearbeitet und auf eine Säule aufgetragen.
*= sieht man in den Bildern.....





Bj68
Benutzer-Profile anzeigenAlle Beiträge von BJ68 anzeigenPrivate Nachricht senden
Illumina-Mitglied

Anmeldedatum: 08.08.2010
Beiträge: 1083
Artikel: 4
Wohnort: Berlin-Pankow
Geschlecht: Geschlecht:Männlich
Alter: 58
@BJ68, Ich bin ja immer wieder begeistert von Deinen interessanten und sehr gut dokumentierten Expis aus der Biochemie!

_________________
"Der einfachste Versuch, den man selbst gemacht hat, ist besser als der schönste, den man nur sieht." (Michael Faraday 1791-1867)

Alles ist Chemie, sofern man es nur "probiret". (Johann Wolfgang von Goethe 1749-1832)

„Dosis sola facit venenum.“ (Theophrastus Bombastus von Hohenheim, genannt Paracelsus 1493-1541)

"Wenn man es nur versucht, so geht´s; das heißt mitunter, doch nicht stets." (Wilhelm Busch 1832 -1908)
Benutzer-Profile anzeigenAlle Beiträge von Uranylacetat anzeigenPrivate Nachricht senden
Illum.-Ass.

Anmeldedatum: 21.04.2008
Beiträge: 667
Artikel: 5
Wohnort: Neuwied Engers
Geschlecht: Geschlecht:Männlich
Alter: 38
Wenn du das als Synthese posten willst, dann pass es doch bitte an die allgemeinen Artikelvorgaben an Wink

Ansonsten echt geil gemacht

_________________
Ich gebe keine Drohungen ab, ich mache nur Versprechungen Wink
Benutzer-Profile anzeigenAlle Beiträge von worldmaker anzeigenPrivate Nachricht sendenICQ-Nummer
Illumina-Moderator

Anmeldedatum: 10.08.2009
Beiträge: 4984
Artikel: 4
Wohnort: Bad Spenza
Geschlecht: Geschlecht:Männlich
Alter: 42
Hammergeil! Wenn ich das richtig verstanden habe wird das Ganze ja verwendet um die Nierenfunktion zu überprüfen. Wird der gebildete Urin dann auf Fluoreszenz untersucht?

_________________

"...wie ein Sprecher betont,hat für die Bevölkerung zu keinem Zeitpunkt Gefahr bestanden."
http://www.youtube.com/watch?v=bn0PgN0HpRY
"...mittlerweile rostet das Miststück..." E.v. Däniken
Benutzer-Profile anzeigenAlle Beiträge von Newclears anzeigenPrivate Nachricht senden
IllumiNobel-Gewinner 2012

Anmeldedatum: 08.05.2011
Beiträge: 807
Artikel: 4
Geschlecht: Geschlecht:Männlich
Newclears hat Folgendes geschrieben:
Hammergeil! Wenn ich das richtig verstanden habe wird das Ganze ja verwendet um die Nierenfunktion zu überprüfen. Wird der gebildete Urin dann auf Fluoreszenz untersucht?



Nein, die Mäuse müssen bluten.....die Abnahme wird im Plasma gemessen, d.h. die Mäuschen werden zur Ader gelassen....und mit einem Nanodrop wird dann die Fluoreszenz gemessen.


BJ68
Benutzer-Profile anzeigenAlle Beiträge von BJ68 anzeigenPrivate Nachricht senden
Illumina-Moderator

Anmeldedatum: 10.08.2009
Beiträge: 4984
Artikel: 4
Wohnort: Bad Spenza
Geschlecht: Geschlecht:Männlich
Alter: 42
Alles klar. Dachte das wäre ein direkter Test. Andererseits macht es natürlich mehr Sinn das Plasma zu messen als den Urin, da dort von einer "stabilen" Zusammensetzung ausgegangen werden kann wohingegen Urin variiert.

_________________

"...wie ein Sprecher betont,hat für die Bevölkerung zu keinem Zeitpunkt Gefahr bestanden."
http://www.youtube.com/watch?v=bn0PgN0HpRY
"...mittlerweile rostet das Miststück..." E.v. Däniken
Benutzer-Profile anzeigenAlle Beiträge von Newclears anzeigenPrivate Nachricht senden
Fluoreszenz markiertes Polyfructosan
Du kannst keine Beiträge in dieses Forum schreiben.
Du kannst auf Beiträge in diesem Forum nicht antworten.
Du kannst deine Beiträge in diesem Forum nicht bearbeiten.
Du kannst deine Beiträge in diesem Forum nicht löschen.
Du kannst an Umfragen in diesem Forum nicht mitmachen.
Alle Zeiten sind GMT + 1 Stunde  
Seite 1 von 1  



Vorheriges Thema anzeigen :: Nächstes Thema anzeigen  
  
   
  Neue Antwort erstellen