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Firefly-Luciferin
NI2
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Totalsynthese von Firefly-Luciferin
((4S)-2-(6-hydroxy-1,3-benzothiazol-2-yl)-4,5-dihydrothiazole-4-carboxylic acid, D-Luciferin, (-)-Luciferin)

Der Begriff Luciferin (vom lat. lucifer, Lichtbringer) bezeichnet verschiedene Naturstoffe, die in biolumineszenzten Organismen vorkommen und das chemilumineszente Substrat einer Biolumineszenz darstellen, deren Oxidation Licht emittiert. Das Chromophor, also das Luciferin, kann bei der Biolumineszenz in drei Formen vorkommen, zum einen als freies Luciferin, als Photoprotein I (Luciferin an katalytisches Protein gebunden) und als Photoprotein II (Luciferin an ein nicht-katalytisches Protein gebunden). Das für die Biolumineszenz erforderliche Enzym wird als Luciferase bezeichnet, wobei sich diese je nach Organismus unterscheiden kann. Das wohl besterforschte Luciferin ist das Firefly-Luciferin verschiedener Insektenarten (von z.B. Photinus pyralis), welches auch oft nur als D-Luciferin bezeichnet wird. Der Prozess der Biolumineszenz am Beispiel des D-Luciferins läuft folgendermaßen ab:

Zunächst wird das Luciferin mit ATP unter katalytischem Einfluss von Mg2+ und Luciferase zum gemischten Anhydrid von Luciferin und Adenosinmonophosphat umgesetzt:



Es bildet sich ein Hydroperoxid:



Dieses reagiert unter Abspaltung von Adenosinmonophosphat weiter zu einem Dioxetanon:



Das Dioxetanon hinterlässt nach Abgabe von CO2 Oxyluziferin im angeregten Zustand:



Dieses kehrt unter Abgabe grünen Lichts in den Grundzustand zurück:





(Quelle: Wikipedia)

D-Luciferin wurde 1949 erstmals isoliert und es wurde nach einem totalsynthetischen Zugang gesucht. Im letzten Schritt bietet sich zur Synthese des richtigen Enantiomers D-Luciferin eine Umsetzung eines Nitrils mit D-Cystein an; weshalb dieser letzte Schritt bei allen gängigen Syntheserouten gleich ist. Die Schwierigkeit liegt in der Synthese des 2-Cyano-6-hydroxybenzothiazols, welches auf verschiedene Wege zugänglich ist. Eine neue Methode stellt dabei eine milde Thiolierung von p-Anisidin und 2-Chloracetamid dar.


Geräte:

diverse Bechergläser und Kolben, Thermometer, Magnetheizrührer mit Ölbad (ggf. Sand- oder Metallbad bis 220 °C), Rückflusskühler, Möglichkeit zur Vakuumfiltration, Schutzgasanlage, optional: Rotationsverdampfer


Chemikalien:

p-Anisidin (T)


Schwefel (F)


Triethylamin (C, F)


2-Chloracetamid (T)


N,N-Dimethylformamid (T)


Natriumhydroxid (C)


Kaliumhexacyanoferrat(III)
Phosphoroxychlorid (C, T+)


Natriumhydrogencarbonat
Pyridinhydrochlorid (Xn)


Natriumsulfat
D-Cystein (Xn)


Salzsäure (2 M) (Xi)


____________

2-(4-Methoxyphenylamino)-2-thiooxoacetamid (?)


6-Methoxybenzothiazol-2-carboxamid (?)


6-Methoxybenzothiazol-2-carbonitril (?)


6-Hydroxybenzothiazol-2-carbonitril (Xn)


D-Luciferin (?)




Hinweis: Bei der Cyclisierung mit rotem Blutlaugensalz entstehen übelriechende Gase, ein gutziehender Abzug wird empfohlen. Vorsicht beim Umgang mit Phosphoroxychlorid.

Durchführung:

2-(4-Methoxyphenylamino)-2-thiooxoacetamid (Thioamid)



Zu einer Mischung von 3,69 g p-Anisidin, 1,92 g Schwefel und 4,8 mL Triethylamin in 60 mL Dimethylformamid werden in kleinen Portionen 3,08 g 2-Chloracetamid zugegeben, sodass die Temperatur nicht über 30 °C (maximal 40 °C!) steigt (falls die Lösung durch das Lösen des p-Anisidins noch kalt ist tritt die Erwärmung bei der Zugabe des Chloracetamids eventuell verzögert und heftig ein). Die Mischung wird für 8 h gerührt, in 600 mL kaltes Wasser gegeben und der entstandene Niederschlag abgesaugt.

Ausbeute: 4,1 g (65 % d. Th. Das Produkt enthält aber noch Schwefel, der erst im nächsten Reaktionsschritt abgetrennt wird.)


6-Methoxybenzothiazol-2-carboxamid (Amid)



3,7 g Natriumhydroxid werden in 33,3 mL Wasser gelöst und 3,11 g des Thioamids zugegeben. Nach wenigen Minuten Rühren wird die trübe Lösung filtriert und somit vom Schwefel getrennt. Das Filtrat wird langsam zu einer Lösung von 14,6 g Kaliumhexacyanoferrat(III) in 111 mL Wasser getropft und nach der Zugabe 60 Minuten gerührt. Der Niederschlag wird filtriert, mit Wasser gewaschen bis das Filtrat farblos ist und anschließend im Vakuum getrocknet.

Ausbeute: 1,86 g (60 % d.Th.)


6-Methoxybenzothiazol-2-carbonitril (Methoxy-Nitril)



4,37 g des Amids werden in 150 mL DMF gelöst und auf 5 °C gekühlt. Dazu werden 4 ml Phosphoroxychlorid gegeben, so dass die Temperatur nicht über 10 °C steigt. Es wird anschließend für 2 h bei Raumtemperatur gerührt und die Mischung danach in 500 mL Eiswasser gegeben. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser gewaschen (es kann aus Hexan oder Heptan umkristallisiert werden) und im Vakuum getrocknet.

Ausbeute: 2,83 g (71 % d.Th.)


6-Hydroxybenzothiazol-2-carbonitril (Hydroxy-Nitril)



5 g Pyridinhydrochlorid werden im Vakuum getrocknet und unter Argon geschmolzen. Zur Schmelze werden 500 mg des Methoxy-Nitrils gegeben, die Mischung unter Rühren und Schutzgas für 3 h bei 220 °C gehalten und über Nacht stehen gelassen. Der dunkle Rückstand wird in Wasser aufgenommen und mit Toluol extrahiert (4 x 50 mL, die organische Phase fluoresziert blau), über Natriumsulfat getrocknet, das Lösungsmittel im Vakuum abgezogen und das Produkt im Vakuum getrocknet.

Ausbeute: ca. 200 mg (ca. 43 % d.Th.)


D-Luciferin



Es werden 110 mg D-Cystein in 2 mL Wasser gelöst und die Lösung mit einer Lösung aus 0,17 g Natriumhydroxid in 1 mL Wasser alkalisch eingestellt. Nach dem Desoxygenieren der Lösung wird das Reaktionsgefäß mit Alufolie umwickelt um die Lösung vor Lichteinwirkung zu schützen. Anschließend werden 120 mg des Hydroxy-Nitrils in 4,5 mL Methanol zugegeben, die Lösung für eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt und anschließend mit 2 M Salzsäure auf pH 2,5 eingestellt und für mindestens 20 Stunden im Kühlschrank stehen gelassen. Der Niederschlag wird filtriert und im Vakuum getrocknet. Das Rohprodukt ist für Chemolumineszenzversuche ausreichend rein, dennoch sind zu diesem Zeitpunkt noch Verunreinigungen enthalten, die säulenchromatographisch abgetrennt werden sollten. Das nach der chromatographischen Reinigung erhaltene Produkt weist ein Absorptionsmaximum bei λ = 327 nm auf, was der Literaturangabe entspricht.

Ausbeute: 70 mg (36 % d.Th., overall: 4,28 %)


Entsorgung:

Die Lösungsmittel werden entsprechend den organischen Lösungsmittelabfällen zugeführt. Da bei dieser Synthese eine größere Menge kontaminierter wässriger Abfälle entstehen, habe ich diese extra gesammelt. Das Produkt wird aufgehoben oder dem organischen Feststoffabfall zugeführt.


Erklärung:

Der Schlüsselschritt dieser Syntheseroute ist das einstufige Erreichen des Thioamids. Ausgehend von diesem sind seit einiger Zeit Syntheserouten bekannt, jedoch war das Thioamid zuvor zu schwer zugänglich. Mit dem 2012 veröffentlichten Paper (siehe Quelle) wurde eine einfache, schnelle und vor allem technische kostengünstige Methode zur Synthese der substituierten Benzothiazol-2-carbonitrile entwickelt.



Das so entstandene Thioamid wird mit rotem Blutlaugensalz oxidativ cyclisiert und das resultierende Säureamid mit Phosphoroxychlorid zum Nitril umgesetzt und anschließend entschützt. Das Hydroxy-Nitril reagiert mit D-Cystein zum gewünschten Enantiomer des Luciferins - dem D-Luciferin.



Das so gewonnene Luciferin eignet sich bereits für Chemilumineszenz-Versuche (in DMF mit DBU), dabei entsteht jedoch nur ein kurzes schwaches Leuchten, welches schwer zu fotografieren ist, da man das Gefäß regelmäßig schütteln muss um ein anhaltendes Leuchten zu erhalten. Die Lösung fluoresziert danach nicht mehr grün sondern grün-gelb-orange und verfärbt sich orange-braun. Die Chemilumineszenz konnte beim gereinigten Produkt bisher jedoch nicht beobachtet werden.
Eine Aufreinigung der einzelnen Stufen wäre sinnvoll um ein reineres Produkt zu erhalten, diese gestaltet sich jedoch teilweise schwieriger als angenommen, deshalb sind die Stoffe dunkler als die entsprechenden Reinstoffe.


Bilder:


Vorgelegter Schwefel mit p-Anisidin


Lösung der Edukte vor Zugabe des Triethylamins







Reaktionsfortschritt nach Zugabe aller Edukte


Gebildeter Niederschlag des Thioamids


Kristalle des reinen Thioamids


Umkristallisiertes Thioamid



Zugabe des Thioamides zum Blutlaugensalz




Reaktion des Amides mit Phosphoroxychlorid


Isoliertes Methoxy-Nitril


Fluoreszenz des Hydroxy-Nitril-Extraktes in Toluol


Cystein-Lösung


Ausfallendes Luciferin


Abfiltriertes Produkt (Rohluciferin)


D-Luciferin nach säulenchromatografischer Reinigung


Übersicht über die einzelnen Stufen


Fluoreszenz des Rohluciferins im Sauren, Neutralen (DMF, durch Verunreinigungen) und Basischen.


Fluoreszenz der Lösung nach einem Chemilumineszenz-Versuch

Danke an Cyanwasserstoff für die UV/VIS-Messung.


Quelle:

- H. Würfel, D. Weiss, R. Beckert, A. Güther - A new application of the “mild thiolation” concept for an efficient three-step synthesis of 2-cyanobenzothiazoles: a new approach to Firefly-luciferin precursors, J. of Sulfur Chemistry 2012, 33, 9-16
- Corinne Farace, B. Blanchot, D. Champiat, P. Couble, G. Declercq, J.-L. Millet - Synthesis and Characterization of a New Substrate of Photinus pyralis Luciferase: 4-Methyl-D-Luciferin, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1990, 28, 471-474

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- da die Ansätze mehrfach durchgeführt wurden (zwei- bis dreimal), werden in der Beschreibung auch größere Mengen eingesetzt als im vorigen Ansatz hergestellt wurden sind. Gleiches Gilt für die Bilder, diese stammen auch aus verschiedenen Ansätzen und können daher von den angegebenen Mengen abweichen.

EDIT:

Nach einigen weiteren Versuchen hat sich gezeigt, dass das Rohluciferin noch die Vorstufe und ein weiteres (Neben-)Produkt enthält, nach einer säulenchromatografischen Reinigung konnte reines Luciferin gewonnen werden. Die CL hat damit bisher nicht funktioniert, was an der verwendeten Menge (<1 mg) gelegen haben könnte. Dennoch sollte nur das Luciferin und nicht die Nebenprodukte zur CL im Stande sein. Die Ausbeute ist durch die Reinigung weit nach unten gegangen, da unter anderem eine Rückstellprobe behalten wurde und einiges an Substanz für Vorversuche und Analytik genutzt wurde. Evtl folgt ein größerer Ansatz, da ich jetzt einen guten Weg gefunden habe das die Nebenprodukte abzutrennen.

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Ausgesprochen geil! Und mit der Aufreinigung des p-Anisidins hast du dir ja scheinbar echt Mühe gegeben - schöne Kristalle, wenn man die mal mit dem kommerziellen Schlonz vergleicht... Very Happy Analytik fügst du auch noch ein (hast du ja, soweit ich weiß?)? Very Happy Kann man das Luciferin denn vernünftig säulen? Rf-Wert? Mit -N=, -S-, -OH und insbesondere -COOH stell ich mir das ein wenig schwierig vor, wäre doch wahrscheinlich auf der Stufe des Methoxy- oder Hydroxynitrils einfacher und vermutlich auch ausreichend.

Zitat:
Übersicht über die einzelnen Stufen


Nachmacher! Razz

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Jaaaa... das Sche*ß-Zeug.... hatte am Anfang schwarzen Schlonz und gefühlt 50 mal Umkristallisiert, real waren es sicherlich so 7 mal. Sah dann am ende so aus:



Das Zeug kristallisiert wirklich schön Smile

Hab gestern auf die Schnell kein Paper gefunden was das Luiciferin säult, und die Bisher probierten Lömis eignen sich nicht dazu. Evtl mal EtOAc/MeOH 9:1 versuchen oder so.

Es sind schon noch einige Verunreinigungen enthalten (3 weitere, aber das Luciferin macht den größten Anteil aus). Wenn ich ein gutes Lömi gefunden habe werde ich vielleicht einen größeren neuen Ansatz machen (müsste nochmal neues Py*HCl machen damits dann reicht) und dabei die einzelnen stufen noch einmal säulen, aber vorerst nicht. Die Calixarene warten auch auf ihre Fertigstellung...
Das Methoxynitril ist laut DC ziemlich sauber (keine weiteren sichtbaren Spots) es wäre beim Hydroxynitril wahrscheinlich sinnvoller, da bei 220 °C sicherlich einiges kaputt geht.

Gar nicht nachgemacht! Meine sind nämlich beschriftet! Razz

EDIT: Hiermit kündige ich schon mal die Chemilumineszenz von D-Luciferin zum Forentreffen 2014 an Cool

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Das ist ja eine interessante Synthese! Ich denke, in der OC muss man wohl oder übel bei solchen mehrstufigen Synthesen meistens Kompromisse bei Ausbeute und Reinheit der Zwischenprodukte und des Endprodukts machen. Von daher finde ich das Ergebnis der Chemolumineszenz recht beachtlich! Wink

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NI2
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Naja wenn man einmal das richtige Lösungsmittel zum säulen gefunden hat bekommt nan schnell gute Reinheiten und Reinstoffe, das ist aber nicht immer so einfach :/

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Re: Firefly-Luciferin
Pok
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Schöne viele bunte Bilder! Very Happy
Das letzte Foto ist aber keine Chemolumineszenz, sondern die Fluoreszenz, oder? Gibts auch Fotos von der CL?
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NI2
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Richtig, es ist "nur" eine Fluoreszenz, da sich das Luciferin bei der CL ja umsetzt ändert sich auch die Farbe der Fluoreszenz und auch der Lösung, und auf dem Bild ist die Lösung NACH der CL zu sehen. Von dieser gibt es leider keine wirklichen Bilder,... Habe nur ein altes, aber das ist weder schön noch aussagekräftig. Die Farbe geht durch die lange Belichtungszeit verloren, aber es ist nicht einfach schöne Bilder hinzubekommen, da man bei den Makroaufnahmen im Dunkeln den Focus schlecht nachkorrigieren kann und bis dahin die CL schon erloschen ist und man neu schütteln muss. Aber man kann sie sehen Smile eine BL wäre mir lieber, aber ich nehme an niemand hat das passende Enzym da?^^

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Feine Sache, ich würde sagen auf der letztens gaaaanz inoffiziell eingeführten linearen Maßeinheit zur Bewertung von Beiträgen "lemmi" (1 lemmi= 1000 millilemmi = 1000000 µlemmi) beruhend ist das exakt ein "lemmi", wenn nicht sogar subjektive 1,9 lemmi wenn man die Arbeit mit einbezieht die dahinter steckt.Wink

Zitat:
eine BL wäre mir lieber, aber ich nehme an niemand hat das passende Enzym da?^^
...Klar, das 50 Kilofass steht im Keller, hab das vor Jahren mal gekauft um Glühwürmchen zu verarschen... wieviel Kilo brauchst du denn? Rolling Eyes Wink Wink Wink

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Pok
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Also ist die (in vitro) Biolumineszenz deutlich heller? Zerpulvere doch einfach ein paar Glühwürmchen. Mr. Green Da wird schon was passendes drin sein. Braucht man nicht auch ATP dafür?

Wenn man die OH-Gruppe da links unten durch ne Amino-Gruppe ersetzt und Selenocystein (?) statt Cystein einsetzt, wäre auch eine rote CL möglich.
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NI2
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Ja... und der Farbton der CL könnte sich auch unterschieden, bin ich mir nicht ganz sicher. Habe sogar noch ne tote Glühwürmchenlarve da... Das Enzym könnte noch intakt sein. ATP hab ich.

Ich weiß, kenne das Paper Wink Aber D-Selenocystein ist nicht bezahlbar^^

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Also, Hannes, das is ne´ ganz andere liga! Hut ab!

Wie lange hast du denn daran gearbeitet? Mich fasziniert das Durchhaltevermögen von euch organischen Synthetikern! Anisidin 8 mal umkristallisieren und dann erst die eigentliche Synthese beginnen! Wow!

Zitat:
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Dann legt den Termin bitte so, daß ich auch mal kommen kann! (nächstes jahr geht bei mir das letzte Juliwochenende Very Happy, danach nicht)

Luciferase müsste doch irgendwo aufzutreiben sein! Vielleicht an einer Uni (Biologie/Biochemie)?

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NI2
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Danke Smile

Sowas dauert halt immer über Wochen/Monate an, meistens macht man ja aber nicht immer was und nach nem Rückschlag hat man gerne mal keinen Bock mehr Smile Das Luciferin selbst habe ich vor wenigen Wochen fertig gemacht, das Nitril als ich damals die Fluoreszenzbilder vom Luciferin gepostet habe. Vom Aufwand selber her geht das ganze, wenn man bei den einzelnen Stufen einmal raushat wie es geht. Das Entschützen war allerdings schon ne ziemlich unschöne Sache, in der Literatur steht auch teilweise merkwüriger kram, weil hier und da die Rede davon ist das Py*HCl im Vakuum @ 220 °C zu trocknen, dabei schmilzt es aber nicht sondern sublimiert einfach in den Kühler. Den Probeansatz habe ich damals so gemacht wie Jan, einfach PyHCl in nem Becherglas ohne Tempkontrolle geschmolzen und die Vorstufe eingegeben. Funktioniert auch, aber bei nem größeren Ansatz wollte ich es schon ein wenig sauberer machen, aber wahrscheinlich reicht da die Q'n'D'-Methode vollkommen aus.

Juli-Wochende? das klingt zeitig, müssen wir noch mal diskutieren bezüglich der Termin findung, wäre ja schln, wenn du auch mal dabei wärst Smile

Habe bisher mal ein wenig rumgefragt, aber leider niemanden gefunden, der damit arbeitet. Ein Milligramm zu kaufen lohnt sich definitiv nicht :/

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Rechtschreibfehler entfernt und...

Zitat:
Da für die Biolumineszenz nur das D-Luciferin geeignet ist...


...falsch! Lembert, N. "Firefly luciferase can use L-luciferin to produce light". Biochem. J. 317 (1): 273–7 (1996).
Daher etwas abgeändert.

Da ich mittlerweile auch so meine Zweifel am tatsächlichen Erfolg meiner alternativen Luciferinsynthese habe, habe ich den Artikel in den Papierkorb verschoben und die Erklärung zur Biolumineszenz in deinen Artikel kopiert.

Verschoben.

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wieso sind diese Bilder so verpixelt?




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