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Bestimmung des Hyoscyamingehaltes in Tollkirschenblättern
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Bestimmung des Hyoscyamingehaltes in Tollkirschenblättern

Die Tollkirsche, Atropa belladonna L., enthält bekanntlich Tropanalkaloide, und zwar ganz überwiegend L-Hyoscyamin neben einem geringen Prozentsatz Scopolamin. In Anlehnung an die Methode des europäischen Arzneibuches stelle ich hier die quantitative Bestimmung des Alkaloidgehaltes in den (wie es im Arzneibuch heißt) "Belladonna“-Blättern vor.


Geräte:

Waage, Chromatographierohr 20 mm weit 20 cm lang mit NS-Ansatz (als Perkolator), Druckausgleich-Tropftrichter, Rundkolben 250 ml und Erlenmeyerkolben 100 ml mit Schliff, Wasserbad mit Magnetrührer und Destilliervorrichtung (Ansatz, Kühler, Vorstoß, Vorlage), Scheidetrichter 75 ml, Zylinderglas mit Schliffstopfen 100 ml, Messzylinder 25 ml, Erlenmeyerkolben 100 ml oder Becherglas, Erlenmeyerkolben 50 ml, Kleine Bechergläser (50 ml), Vollpipette 10 ml, Feinbürette (10 ml)


Chemikalien:

getrocknete Tollkirschenblätter (T)


Diäthylether (F, Xn)


Ethanol 96 % (F)


Ammoniaklösung 25 % (C, N)


Chloroform (Xn)


Natriumsulfat, wasserfrei

Natriumchlorid (gesättigte Lösung)

Schwefelsäure 1 N (C)


Natronlauge 1N (C)


Methylrot-Mischindikatorlösung (F)

(100 mg Methylrot und 50 mg Methylenblau in 100 ml Ethanol 96 %)

Dragendorff-Reagenz (nach Ph. Eur.: 0,43 g basisches Bismutnitrat, 50 ml Essigsäure, 4 g Kaliumjodid und 30 ml Wasser)


Hinweis:
Tollkirschenblätter sind giftig. Hyoscyamin und verwandte Tropanalkaloide sind stark giftig. Die hier extrahierten Mengen sind zwar ein gutes Stück von der letalen Dosis für Erwachsene entfernt, können bei Einnahme jedoch durchaus erhebliche Vergiftungserscheinungen bewirken.


Durchführung:

Zur quantitativen Extraktion der Alkaloide aus der Droge schreiben die Arzneibücher die sogenannte Perkolation vor. Als Perkolator kann ein Chromatographierohr verwendet werden, in das zunächst ein kleiner Wattebausch gesteckt wurde. Dann werden genau 5 g der getrockneten, gepulverten Tollkirschenblättern (zur Pflanze siehe meinen Beitrag hier) abgewogen, in kleinen Portionen in das Rohr gegeben und portionsweise mit einer Mischung aus 30 ml Ether, 10 ml Ethanol 96 % und 5 ml Ammoniaklösung 25 % versetzt, so dass das Pulver komplett durchtränkt wird und keine Luftblasen zwischen dem Drogenmaterial zurückbleiben. Wenn alles eingetragen ist, wird oben mit einer Lage Glaskugeln abgeschlossen und noch so viel der genannten Mischung aufgegossen, dass sie 5-10 mm über den Kugeln steht. Der Perkolator wird dann mit einem Stopfen gut verschlossen und zur Mazeration (Einweichen) der Droge 4 Stunden stehen gelassen. Anschließend wird mit Ether perkoliert (das Arzneibuch verwendet dazu eine Mischung aus 3 Volumenteilen Ether und 1 Volumenteil Chloroform). 100 ml Ether werden in den Druckausgleich-Tropftrichter einer Gasentwicklungsapparatur gegeben und diesen oben auf den Perkolator gesetzt.

Die Perkolation geht so vor sich, dass man gleichzeitig den Hahn des Tropftrichters und den des Perkolators öffnet und genau so viel frischen Ether von oben zutropfen lässt, wie Extrakt von unten abtropft. Dabei darf die Oberfläche des zu perkolierenden Drogenmaterials nie trockenfallen, das heißt das Menstruum (der Ether) muss immer einige Millimeter über den Glaskugeln stehen. Letztere verhindern ein Aufwirbeln des Materials beim Zutropfen des Ethers von oben. Bei einer Geschwindigkeit von ca. 2-3 Tropfen pro Sekunde dauert die gesamte Extraktion etwa 30 Minuten. Nachdem jeweils ca. 25 ml des Ethers zugegeben wurden, wird ½ ml des aus dem Rohr auslaufenden Extraktes (20 Tropfen) in Reagenzgläsern aufgefangen, den Ether durch Einstellen der Gläser in heißes Wasser verdampft und dann die Rückstände in 0,5 ml 1N Schwefelsäure und 5 ml Wasser gelöst. Nach Zugabe von 5 Tropfen Dragendorff´s Reagenz entsteht, solange der Extrakt noch alkaloidhaltig abläuft, ein dichter Niederschlag. Nach Durchlauf von 75-80 ml des Menstruums fällt die Probe negativ aus und die Perkolation wird beendet. Der erhaltene etherische Extrakt ist tiefgrün gefärbt.

Den Kolben schließt man dann an einen Kühler an und destilliert den Ether aus einem heißen, aber nicht siedenden, Wasserbad bis auf einen Rest von ca. 20 ml ab. Der solcherart eingeengte Extrakt wird in einen Scheidetrichter überführt und der Kolben noch dreimal mit je 5-8 ml Ether nachgespült, bis kein Chlorophyllrückstand mehr darin zu erkennen ist (das Chlorophyll ist quasi der Marker für die quantitative Überführung der extrahierten Pflanzenstoffe in den Scheidetrichter). Anschließend wird dreimal mit je 15 ml 0,5 N Schwefelsäure ausgeschüttelt. Wenn eine Emulsionsbildung eintritt, werden etwa 10 ml gesättigte Kochsalzlösung zugegeben. Die Trennung der Phasen gelingt damit oft gut binnen 5-10 Minuten. Die vereinigten schwefelsauren wässrigen Phasen werden dann mit 2-3 ml Ammoniaklösung (immer 25 %ige) alkalisiert und erneut dreimal im Scheidetrichter ausgeschüttelt, diesmal mit je 15 ml Chloroform. Dabei geht die Trennung ziemlich unproblematisch vor sich. Sie dauert rund eine Viertelstunde.

Die vereinigten Chloroformauszüge lässt man in einem Schliffstopfenglas über einem großen Spatel wasserfreiem Natriumsulfat unter gelegentlichem Schwenken eine Stunde stehen. Während dieser Zeit wird die anfangs leicht trübe Flüssigkeit wasserklar. Nach Ablauf der Zeit wird der Chloroformextrakt in einen 100 ml Schliff-Erlenmeyerkolben abgegossen, das zurückbleibende Natriumsulfat unter Schwenken dreimal mit 8 ml Chloroform ausgewaschen und die Waschflüssigkeiten zu dem Auszug in den Kolben gegeben. Aus dem Kolben wird dann das Chloroform wie zuvor der Ether auf dem Wasserbad abdestilliert. Dabei rührt man ständig mit Hilfe eines Rührfisches, um Siedeverzüge zu vermeiden. Wenn das Lösungsmittel vollständig abdestilliert ist, wird der Kolben offen für 20 Minuten in einen auf 100°C vorgeheizten Ofen gestellt. Danach befindet sich im Kolben befindet sich ein trockener, geruchloser grünbrauner Rückstand, der teils an der Wandung, teils am Rührfisch klebt.

Nach vollständiger Abkühlung werden abermals 3 ml Chloroform in den Kolben gegeben, in dem sich die Rückstände sofort zu einer tiefgrünen Flüssigkeit lösen. Als nächstes gibt man mit der Messpipette genau 10,00 ml 0,02 N-Schwefelsäure zu und stellt das Ganze in einen Topf mit heißem Wasser vor das offene Fenster. Dabei kommt das Chloroform rasch ins Sieden und verdampft. Die resultierende Lösung ist jetzt nur noch ganz blass gelbbraun gefärbt. Das Chlorophyll und die übrigen wasserunlöslichen Begleitstoffe bleiben an den Wand des Kolbens hängen.

Schließlich titriert man die überschüssige Schwefelsäure mit 0,02 N Natronlauge zurück. Man gießt die saure Lösung aus dem Erlenmeyerkolben mitsamt Rührfisch in einen kleinen 50 ml-Kolben um und spült noch zwei- bis dreimal mit je 2 ml destilliertem Wasser nach. Als Indikator werden 5 Tropfen Methylrot-Mischindikator zugegeben. Dieser ist im sauren Milieu violett gefärbt. Es wird bis zum Farbwechsel nach grün titriert, wobei man sich am besten an der Farbe einer Vergleichslösung orientiert die 10,0 ml 0,02 N Schwefelsäure mit 5 Tropfen Indikatorlösung enthält und mit 0,02 N Natronlauge bis zum Farbumschlag titriert wurde.

Bei diesem Versuch wurden zur Neutralisation der Untersuchungslösung 3,55 ml der 0,02 N Natronlauge verbraucht.


Entsorgung:

Die austitrierte Flüssigkeit wird über das Abwasser entsorgt. Der aus den Extrakten abdestillierte Ether wird über Calciumchlorid (um mit abdestilliertes Ethanol zu binden), das Chloroform über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann rektifiziert um die Lösungsmittel wieder zugewinnen.


Erklärung:

Zur Abtrennung des Hyoscyamins von den anderen Pflanzeninhaltsstoffen wird es zunächst durch Mazeration (einwirken lassen) der Tollkirschenblätter mit Ammoniak aus seinen Salzen in Freiheit gesetzt und dann mit Ether extrahiert. Die Perkolation erlaubt es, die Droge quantitativ zu extrahieren, denn von oben tropft kontinuierlich frisches Extraktionsmittel nach, während der konzentrierte Extrakt unten abläuft. Die Alkaloide werden quasi nach unten "ausgewaschen". Die anschließende Trennung von den mitextrahierten Begleitstoffen folgt dem Prinzip der abwechselnden sauer-alkalischen Ausschüttelung (siehe das Schema hier). Bei diesem Versuch habe ich zur Ausschüttelung Chloroform verwendet (wie es das Arzneibuch vorsieht), da Hyoscyamin in Chloroform viel besser löslich ist als in Ether (ca. 1:50, die Löslichkeit in Wasser beträgt rund 1:600). Das Chloroform wird danach abgedampft und der Rückstand bei 100°C mindestens 15 Minuten getrocknet, damit sich Spuren von Ammoniak sowie eventuell vorhandene andere organische Basen (Amine) verflüchtigen, da sonst ein zu hoher Alkaloidgehalt vorgetäuscht wird.

Hyoscyamin (Racemat: Atropin) ist ein einbasisches Alkaloid. 1 mol Hyoscyamin wird durch ½ Mol Schwefelsäure neutralisiert und es bildet sich das Sulfat:



Molmasse Hyoscyamin: 289,4 g
1 ml 0,02 N Schwefelsäure entsprechen: 289,4 : 50 = 5,788 mg Hyoscyamin.

Da Scopolamin unter 5% der in den Tollkirschenblättern vorhandenen Alkaloide ausmacht, wird seine etwas höhere Molmasse bei der Berechnung nicht berücksichtigt. Die Arzneibücher nennen das einen "Gehalt berechnet als Hyoscyamin".

Ich hatte die Titer meiner Maßlösungen vor dem Versuch getrennt anhand von Urtitersubstanzen bestimmt und folgende Werte gefunden:
0,02 N NaOH: f=1,008
0,02 N H2SO4: f=0,99

Es waren 10,0 ml der 0,02 N H2SO4 vorgelegt worden, diese entsprechen 9,9 ml einer exakt 0,02 N-Säure. Zur Rücktitration wurden 3,55 ml 0,02 N NaOH verbraucht, was bei Faktor 1,008 einer Menge von 3,578 ml entspricht. Die extrahierten Alkaloide hatten also 6,322 ml der Schwefelsäure neutralisiert. Das entspricht 36,59 mg Hyoscyamin, die in 5 g Tollkirschenblättern enthalten gewesen waren - ein Gehalt von 0,73 %.

Dieser Hyoscyamingehalt ist ungewöhnlich hoch! Dabei hatte ich die Blätter nicht mal vorgetrocknet (lufttrockene Belladonnablätter enthalten 5-8 % Wasser, der Alkaloidgehalt der trockenen Droge wäre also sogar noch etwas höher). Nach dem Arzneibuch müssen (getrocknete) Belladonnablätter mindestens 0,3 %, sogenannte "eingestellte Belladonnablätter" genau 0,3 % Alkaloide enthalten (zum Einstellen wird Blätterpulver mit höherem Gehalt durch vermischen mit Milchzucker oder Blätterpulver eines niedrigeren Alkaloidgehaltes quasi "verdünnt"). Der Durchschnittsgehalt der Rohdroge liegt bei 0,3 bis 0,5 %, wobei Einzelfälle von bis zu 1 % Hyoscyamin beschrieben worden sind. 2012 muss ein guter Jahrgang für Tollkirschenblätter gewesen sein!


Bilder:


Perkolation der Belladonnablätter mit Ether


Dragendorff-Reaktion in verschiedenen Phasen der Perkolation, zuletzt (ganz rechts) negativ ausfallend


Einengen des Perkolates auf dem Wasserbad


Ausschütteln des etherischen Extraktes mit 0,5 N Schwefelsäure


Ausschütteln der wässrigen Phase mit Chloroform nach Zugabe von Ammoniak


Trocknen des Chloroformauszuges mit Natriumsulfat


Abdampfen des Chlororforms


getrockneter Rückstand des Chloroformauszugs


titrierfertige Flüssigkeit (nach Zugabe von Chloroform und 0,02 N Schwefelsäure und nach Abdampfen des Chloroforms)


Farbumschlag bei der Titration


Farben des Methylrot-Mischindikators, ganz rechts die beschriebene Vergleichslösung

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NI2
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Super! So muss das sein! Very Happy

Hab's mal kurz überflogen.

ein paar Kleinigkeiten: vor %-Zeichen ebenfalls ein Leerzeichen und die Bezeichnungen der Enantiomere mit Großbuchstaben, also "D" oder "L" und nicht "d" und "l" (hat man früher gemacht, wird aber heute nicht mehr gehandhabt, auch Möglich wären "R" und "S" oder "+" und "-", aber "D" und "L" ist ebenfalls noch okay.)

für die Stukturfomeln brauchste es aber nur zu ändern, falls du die files noch gespeichert hast und es schnell ändern kannst.


Grüße

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NI2 hat Folgendes geschrieben:

ein paar Kleinigkeiten: vor %-Zeichen ebenfalls ein Leerzeichen und die Bezeichnungen der Enantiomere mit Großbuchstaben, also "D" oder "L" und nicht "d" und "l" (hat man früher gemacht, wird aber heute nicht mehr gehandhabt, auch Möglich wären "R" und "S" oder "+" und "-", aber "D" und "L" ist ebenfalls noch okay.)


Ist korrigiert. Ich gebe zu, daß ich in der Nomenklatur der Stereoisomere nicht mehr so firm bin....

Bei der Versuchsbeschreibung habe ich - der Form halber - ein paar interessante Einzelheiten ausgelassen, die ich hier noch anfügen möchte. Einmal habe ich bei der Ausschüttelung der Etherpase mit Schwefelsäure nur zweimal Erfolg gehabt. Beim dritten Mal trat eine durch nichts zu beseitigende Emusionsbildung auf. Dennoch scheint die Extraktion der Alkaloide weitgehend quantitativ gewesen zu sein. Ob das bei Verwendung von Ether-Chloroform zur Perkolation (wie die Ph.Eur. vorschreibt) besser geht, weiß ich nicht, bezweifle es aber. Nachteilig bei der Variante mit Chloroform fand ich, daß man nach dem Einengen einen stark chloroformhaltigen Rückstand erhält, den man erst mit reichlich Ether verdünnen muss, um zum Ausschütteln eine Flüssigkeit zu erhalten, deren Dichte kleiner als die des Wassers ist.

Ausserdem habe ich nach Ende der Titration die austitrierte Flüssigkeit nochmals alkalisiert, mit Ether ausgeschüttelt, diesen verdampft, den Rückstand in Methanol aufgenommen und damit zwei DCs gemacht. Eine Platte ist mit Dragendorff entwickelt, eine mit Ninhydrin (+ Erhitzen), links lief eine Referenzlösung (Atropin+Scopolamin) mit:



Zweck war, auf eventuelle Amine zu prüfen, die das Ergebnis hätten verfälschen können. In der mit Dragendorff entwickelten DC sieht man das Hyoscyamin, darüber Apoatropin (Dehydrierugngprodukt von Hyoscyamin, entsteht bei der Extraktion) ganz schwach das Scopolamin, und weiter oben eine scwache Bande, deren Zuordnung mir genauso wenig klar ist, wie die Zugehörigkeit der Bande unter dem Hyoscyamin. Mit Ninhydrin färben sich die Alkaloide schwach an, andere Zonen (Stoffe mit freier Aminogruppe) finden sich nicht, so daß ich denke, dass das Ergebnis korrekt ist.

lemmi

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Eine sehr schöne Dokumentation!

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NI2
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edit by NI2: kleine Rechtschreibfehler korrigiert und verschoben.

Allerdings würde ich noch anmerken, dass Roth und Daunderer schreiben, dass der Gesamtalkaloidgehalt bei 0,1-1,2 % liegt, wobei davon ~70% auf das Hyoscyamin zurückfallen, was etwa 0,84 % entsprechen, damit würde der Wert für deine Probe in einem normalen Bereich liegt. Könntest du sagen, woher deine Information stammt?

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