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Bestimmung des Amygdalingehaltes in bitteren Mandeln
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Bestimmung des Amygdalingehaltes in bitteren Mandeln

Wie allgemein bekannt, enthalten bittere Mandeln das cyanogene Glykosid Amygdalin. Im folgenden habe ich ein Verfahren dokumentiert, den Amygdalingehalt der Bittermandeln über die Spaltung des Glykosids und Titration der freigesetzten Blausäure zu bestimmen. Die Methode hat eine pharmaziehistorische Tradition, denn Wasserdampfdestillate aus Bittermandeln waren als Aqua amgdalarum amarum über mehr als hundert Jahre ein fester Bestandteil der deutschen Arzneibücher. Erst mit dem Erscheinen des DAB7 (1968) wurde das Bittermandelwasser als Arzneimittel „ausrangiert“.


Material:

Reagenzgläser mit Stopfen, kleine Reibschale
Mandelmühle (Küchengerät), 250 ml-Becherglas, Brenner mit Dreifuß und Drahtnetz, Wasserdampfdestillationsapparatur (bestehend aus, 250 ml-Rundkolben in Heizpilz mit durchbohrtem Stopfen und Glasrohr, 500 ml-Dreihals-Rundkolben, Liebigkühler, Vorlagen), Waschflasche, 50 ml-Messzylinder, Reagenzgläser
Feinbürette 10 ml, Magnetrührer (optional), 250 ml-Becherglas


Chemikalien:


Kaliumjodid

Eisen-II-sulfat

Pikrinsäurepapier

Natriumcarbonat (Xi)


Natronlauge 1N (C)


Salzsäure 1N (C)


Schiff´sches Reagenz (fuchsinschweflige Säure) (Xn)


Silbernitratlösung 0,1N. (C)


Ammoniaklösung 10% (ca. 6N) (C)



Analysengut:
Bittere Mandeln (Xn)




Sicherheitshinweise:

VORSICHT! Bei diesen Versuchen wird Cyanwasserstoff erzeugt, der sehr giftig ist. Man sollte unter dem Abzug arbeiten!


Versuchsdurchführung:

1. qualitativer Nachweis von Amygdalin in Obstkernen


Zunächst wollte ich den Nachweis der cyanogenen Glykoside in verschiedenen Obstkernen führen. Zur Verfügung standen mit Apfelkerne, Pfirsischkerne, Aprikosenkerne, Kirschkerne und eben bittere Mandeln. Über den Sommer hatte ich vor allem Aprikosenkerne gesammelt, da in den älteren Pharmakopöen immer darauf hingewiesen wird, dass sich Bittermandelwasser auch aus diesen gut herstellen ließe. Auch die Bittermandeln waren selbst gesammelt. Ich hatte sie schon vor etlichen Jahren von einem Mittelmeer-Urlaub mitgebracht, und zwar „original verpackt“ in der Schale, so wie ich sie vom Boden aufgelesen hatte. Seither fristen sie ihr Dasein in einem alten Standgefäß auf dem Küchenschrank.





Zum Nachweis der Glykoside bin ich nach GUIGNARD vorgegangen. Die Kerne wurden geöffnet (was, nebenbei bemerkt, ziemlich mühselig ist!) dann in der Reibschale zerquetscht, und einen Spatel voll davon mit ein paar Tropfen Wasser in Reagenzgläser gegeben, in die ich einen Streifen frisch mit Natriumcarbonatlösung angefeuchtetes Pikrinsäurepapier gehängt habe. Das Reagenzglas ganz links ist leer und dient als Blindprobe.



Wie man nach einer Viertelstunde eindeutig erkennt, wird aus allen Kernen Cyanwasserstoff freigesetzt – mit Ausnahme meiner extra gesammelten Aprikosenkerne! Es muss sich um eine Amygdalin-freie Züchtung gehandelt haben. Ich musste also doch auf die bitteren Mandeln zurückgreifen.


2. Herstellung von Bittermandelwasser durch Wasserdampfdestillation

Um aus den bitteren Mandeln die Blausäure möglichst quantitativ freisetzen und abdestillieren zu können bin ich einem Vorschlag Michael Pettenkofers (nicht zu verwechseln mit dem Münchener „Hofapotheker“ Max Pettenkofer) von 1861 gefolgt. Ich habe 30 g bittere Mandelkerne zunächst für 20 Minuten im Backofen auf 100 °C erhitzt und dann in einer einfachen Küchenreibe gemahlen. Da die Mandeln ziemlich viel fettes Öl enthalten, habe ich versucht, sie mit einer Spätzlepresse auszupressen, jedoch ohne Erfolg. Also habe ich das Mandelpulver ohne Entfettung weiter verarbeitet und als nächstes in 100 ml kochendes Aqua dest. eingerührt.





Dier erhaltene Aufschlämmung habe ich noch heiß in den Dreihalskolben überführt, der später zur Wasserdampfdestillation dienen sollte, und die Mischung unter gelegentlichem Schwenken verschlossen auf Zimmertemperatur abkühlen gelassen. Sie roch fast gar nicht nach Bittermandeln. Dann habe ich 5 g meiner Aprikosenkerne ebenfalls gemahlen, in der Reibschale gut zerquetscht, zu dem Mandelbrei in den Kolben gegeben und 8 Stunden stehen gelassen. Danach war beim Öffnen des Kolbens ein kräftiger, stechender Bittermandelgeruch wahrnehmbar. Anschließend wurde die Mischung einer Wasserdampfdestillation unterworfen. Ich habe folgende Apparatur aufgebaut:



Sobald das Wasser im Rundkolben siedet, wird der Dreihalskolben angeheizt. Den Vorstoß habe ich mit einem Glasröhrchen verlängert, so dass er bis auf den Boden der Vorlage reichte, den ich mit etwas Wasser (3 ml) bedeckt hatte, in welches das Glasrohr eintauchte. Ganz rechts ist eine Waschflasche angeschlossen, die mit verdünnter (ca. 2 %iger) Natronlauge gefüllt ist. Ein eingehängtes Reagenzpapier sollte mich warnen, falls doch Cyanwasserstoff entweichen sollte.



Die Destillation ging recht zügig von statten. Nach 15 Minuten waren etwa 30 ml Destillat übergegangen (da die Arzneibücher vorschreiben, aus 1 Gewichtsteil Mandeln 1 Gewichtsteil Destillat zu gewinnen, hatte ich an der Außenseite der Vorlage eine Markierung gemacht). Übrigens ging das Destillat über, ohne dass Gasblasen durch die Vorlage oder die Sicherheitswaschflasche austraten. Ich habe die Vorlage gewechselt und nochmals 15 Minuten destilliert. So erhielt ich zwei Fraktionen (nach genauem Abmessen im Messzylinder):

Destillat I: 33 ml
Destilllat II: 33 ml

Das Reagenzpapier in der Waschflasche hatte sich während des gesamten Versuches nicht verfärbt. Als ich aber nach Ende der Destillation ein Papier in den Dampfraum vor dem Kühler einhängte, zeigte es nach einiger Zeit doch eine deutliche Rotfärbung.



War das Amygdalin der Mandeln komplett zersetzt worden? Um das wenigstens abschätzen zu können habe ich eine - zugegebenermaßen ziemlich grobe - Prüfung vorgenommen: ich habe eine Löffelspitze des Destillationsrückstandes abgeschmeckt! Es war kein bitterer Geschmack mehr wahrnehmbar.

Die Destillate I und II riechen beide nach Bittermandeln, jedoch deutlich verschieden. Im Destillat I ist der Geruch stechend und unangenehm, während das Destillat II viel weicher und angenehmer riecht. Um die Destillate orientierend auf das Vorhandensein von HCN bzw. Benzaldehyd zu untersuchen habe ich zwei Reaktionen durchgeführt.

• Zu je 1 ml Destillat I und II habe ich eine Spatelspitze Eisen-II-sulfat und 1 Tropfen Natronlauge 1N gegeben. Nach dem Umschütteln habe ich mit 1 ml 1N Salzsäure angesäuert. Im Destillat I entstand eine kräftige Blaufärbung, im Destillat II nur eine ganz blasse.
• Zu je 2,5 ml Schiff´schem Reagenz habe ich 0,5 ml Destillat I bzw. II gegeben. Nach ca. 3 Minuten entstand mit Destillat II eine deutliche Rosafärbung, mit Destillat I dagegen kaum.



Offenbar ist die Hauptmenge des Cyanwasserstoffs in Destillat I enthalten, während das Destillat II mehr Benzaldehyd enthält. Dies könnte auch die unterschiedliche Geruchsnote erklären. Alternativ wäre denkbar, dass der Benzaldehyd in I überwiegend an Cyanwasserstoff gebunden ist und nicht mit dem Schiff´schen Reagenz reagiert.
Ich habe die Destillate nach dem Versuch aufgehoben und 10 Monate später erneut mit Schiff'schem Reagenz untersucht. Das Ergebnis ist interessant:



Die Rotfärbung ist (es wurden gleiche Substanzmengen eingesetzt!) intensiver als in den frischen Präparaten. Das liegt wahrscheinlich daran, daß die enthaltene Blausäure zwischenzeitlich allmählich hydrolysiert ist und dadurch die Spaltung des initial noch vorhandenen Mandelsäurenitrils zu einer Zunahme des Banzaldehydgehaltes geführt hat.


3. Ermittlung des Amygdalingehaltes durch Titration der freigesetzten Blausäure

Im Becherglas wird die zu untersuchende Probe mit 2 ml Ammoniaklösung 10% versetzt, eine Spatelspitze Kaliumjodid (ca. 0,2-0,3 g) zugefügt und mit destilliertem Wasser auf 80-100 ml aufgefüllt. Die Flüssigkeit wird dann auf dem Magnetrührer auf eine dunkle Unterlage gestellt und mit 0,1N Silbernitratlösung aus der Feinbürette titriert. Man bemerkt bald, dass sich um jeden einfallenden Tropfen gelbweiße Wolken bilden, die sich zunächst rasch wieder vollständig auflösen. Die Titration muss dann sehr langsam geschehen. Sie wird beendet, sobald sich eine permanente opaleszierende Trübung von Silberjodid bildet. Je 1 ml 0,1N AgNO3-lösung entsprechen 5,4 mg HCN



Da die Destillate verschieden „gehaltvoll“ waren, habe ich unterschiedliche Mengen eingesetzt:

Für 10 ml Destillat I betrug der Verbrauch 5,1 ml - entsprechend 27,54 mg HCN (0,2754 %)
Für 25 ml Destillat II betrug der Verbrauch 0,525 ml - entsprechend 2,8 mg HCN (0,0112%)

Da ich von jedem Destillat 33 ml erhalten hatte, hatte ich im ganzen 94,5 mg Cyanwasserstoff aus meinen Bittermandeln abdestilliert. Indem 457,4 g Amygdalin (1 mol) 27 g Blausäure (1 mol) ergeben, enthielten meine 30 g Bitteren Mandeln also 1600,9 mg Amygdalin, was einem Gehalt von 5,3% entspricht. Das ist ein ziemlich hoher Wert (Literatur: 3-5%), der sich wahrscheinlich durch die jahrelange Lagerung erklärt, die doch zu einem allmählichen Wasserverlust der Mandelkerne geführt haben muss.

Auch die Gehaltsbestimmung des Destillates I habe ich nach 10 Monaten wiederholt und einen um rund 30% niedrigeren Wert gefunden. Für 10 ml Destillat I betrug der Verbrauch 3,35 ml, entsprechend 18,09 mg HCN (0,181 %)



Entsorgung:

Die Rückstände werden über den Hausmüll/das Abwasser entsorgt. Die austritrierte Lösung gibt man in den anorganischen Sondermüll.


Erläuterungen:

Cyanogene Glykoside bestehen – wie alle Glykoside – aus einem Zuckeranteil und einem sogenannten Aglykon. Als Aglykon kommen in der Natur aromatische und aliphatische 2-Hydroxynitrile vor. Amygdalin besteht aus zwei Molekülen ß-D-Glucose, die 1-6-glykosidisch zu dem Disaccharid Gentobiose verknüpft sind, und Mandelsäurenitril.



Ein cyanogenes Glykosid mit aliphatischem Aglykon ist z.B. das Linamarin, das im Maniok vorkommt
Die Freisetzung der Blausäure aus dem Amygdalin verläuft nach folgender Reaktion:



Zunächst spalten ß-Glucosidasen ein Traubenzuckermolekül ab und es entsteht das nächst einfachere Glykosid, Prunasin (das übrigens der HCN-freisetzende Bestandteil der Apfelkerne ist, und dessen S-Enantiomer als Sambunigrin im schwarzen Holunder vorkommt). Durch die Abspaltung des zweiten Glucosemoleküls wird Mandelsäurenitril frei, das wiederum spontan oder unter Mitwirkung eines weiteren Enzyms, einer Hydroxynitril-Lyase (die in den Mandeln vorkommende Variante wird Emulsin genannt) in Cyanwasserstoff und Benzaldehyd zerfällt. Dabei handelt es sich um eine Gleichgewichtsreaktion, das heißt, ein Teil der Blausäure vereinigt sich wieder mit dem Benzaldehyd zu Mandelsäurenitril.

Amygdalin gehört zu den wenigen Substanzen, die eingenommen wesentlich giftiger sind, als wenn sie direkt in die Blutbahn geraten. Injiziert man die Substanz Mäusen intraperitoneal (in die Bauchhöhle), so wirken erst 5000 mg/kg tödlich. Bei oraler Zufuhr (über den Mund) sind dagegen 350 mg/kg eine letale Dosis. Aber auch diese Menge ist relativ groß. Sie entspräche (wenn man die Daten von der Maus überträgt, was nicht ohne weiteres statthaft ist!) bei einem erwachsenen Menschen rund 25 g Amygdalin und damit etwa 5 kg Bittermandeln. Die tödliche Dosis der freien Blausäure beträgt dagegen nur etwa 50-70 mg und ist in etwa 20 g Bittermandeln enthalten. Wie erklärt sich das?

Die Magensäure (etwa 0,1 N HCl) allein - ohne Mitwirkung der in den Mandeln ebenfalls enthaltenen Enzyme - ist nicht in der Lage, aus dem Amygdalin rasch genug Blausäure freizusetzen um eine Giftwirkung zu erreichen. Im Blut kommen die genannten Enzyme praktisch gar nicht vor. Die Amygdalinspaltung geschieht im Magen-Darm-Trakt vor allem durch ß-Glucosidasen, die von den dort ansässigen Bakterien gebildet werden. Gleichzeitig wird die entstehende HCN aber in der Leber konstant durch enzymatische Überführung in Thiocyanat entgiftet, und zwar mit einer Rate von ca. 60 mg/Stunde. Reines Amygdalin ist eingenommen also relativ wenig giftig. Bittermandeln sind deswegen giftig, weil sie die zur Spaltung des Amygdalins benötigten Enzyme gleich mitbringen. Etwa 30-50 g Bittere Mandeln gelten als dosis letalis. Es wird angenommen, dass die cyanogenen Glykoside sich während der Evolution als Fraßschutz entwickelt haben.

Vor meiner Wasserdampfdestillation hatte ich die gemahlenen Mandeln in kochendes Wasser gegeben, um zunächst das Amygdalin besser herauszulösen. Dadurch werden natürlich die Enyzme inaktiviert. Durch den Zusatz der Aprikosenkerne (die selbst ja kein Amygdalin enthielten!) wurden die Enzyme wieder zugeführt und die Zersetzung des Amygdalins eingeleitet. Diese Vorgehensweise ist die Idee Pettenkofers gewesen, die er vor 150 Jahren veröffentlichte.

Die Titration der freigesetzten Blausäure entspricht der Cyanidbestimmung nach Liebig. Das zugesetzte Ammoniak behebt auch zwei bei der Gehaltsbestimmung des Bittermandelwassers auftretende Probleme auf. Erstens ist freie Blausäure nicht gut mit AgNO3 zu titrieren, weil sie wenig dissoziiert ist und die freiwerdenden H+-Ionen, das Gleichgewicht zur Seite der Ausgangsstoffe verschieben. Zweitens vereinigt sich die freie HCN mit dem ebenfalls vorhandenen Benzaldehyd zu Mandelsäurenitril (Gleichgewicht, siehe oben), das nicht oder nur sehr langsam mit Silberionen reagiert. Durch das Ammoniak wird der Cyanwasserstoff in Cyanidionen überführt, die Spaltung des Nitrils wird vollständig und das Cyanid kann quantitativ mit Silbernitrat umgesetzt werden.

Die Blausäure hydrolysiert in wässriger Lösung mit der Zeit spontan unter Bildung von Ammoniumformiat, wodurch der Gehalt allmählich abnimmt:

HCN + 2 H2O ---> HCOONH4


Literatur:
Frerichs G, Arends G, Zörnig H: Hagers Handbuch der pharmazeutischen Praxis, Springer-Verlag Berlin-Göttingen-Heidelberg 1949
Mohr, F: Commentar zur Preussischen Pharmakopoe nebst Übersetzung des Textes - dritte umgearbeitete Auflage nach der siebenten Auflage der Pharmacopoea Borussica; Braunschweig, Druck und Verlag von Friedrich Vieweg und Sohn, 1863
Poethke, Walter: Praktikum der Maßanalyse; Verlag Harri Deutsch, Thun und Frankfurt am Main 1980
Steinegger E und Hänsel R: Lehrbuch der Pharmakognoszie und Phytopharmazie, 4. Auflage; Springer-Verlag Berlin-Heidelberg-New York-London-Paris-Tokyo 1988

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Eine klassische Analyse mit interessanten Ergebnissen!

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