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Bakterielle Endosporen
Alf
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Bakterielle Endosporen


Endosporen sind die Überdauerungsformen von Bakterien. Endosporen werden bei konventionellen Färbungen nicht angefärbt. Mit Hilfe der hier vorgestellten Methode kann man sie spezifisch anfärben und so nachweisen.


Geräte:
Objektträger, Pipetten, Deckglas, Mikroskop, Präpariernadel, Bechergläser, Bunsenbrenner, Waage, Agarplatte, 1 ml Spritze


Chemikalien:

Kaliumdichromat (C, N, O, T, Xn)



Schwefelsäure 96 % (C)



Schwefelsäure 2 % (C)



Fuchsin (Xi, Xn)



Ethanol 96 % (F, Xi)



Methylenblau (Xi)



Kalilauge 1 % (C)



Bakterienkultur


0,9 % Kochsalzlösung

Aqua dest.

Immersionsöl


Hinweis:

Vorsicht beim Umgang mit carcinogenen Chrom(VI)-Verbindungen. Die hergestellten Farbstofflösungen färben auch Gewand hervorragend. Die angezüchteten Bakterien sind normale Umgebungskeime und in der Regel geht von ihnen keine Gefahr aus, trotzdem sollte man hygienisch arbeiten!


Durchführung:

Die Bakterien gewinnt man am einfachsten durch Anzüchten auf einer Agarplatte, die man entweder kauft, oder selbst gießt.
Man beimpft die Platte, indem man sie einfach der Luft aussetzt, oder mit einem Wattestäbchen Abstriche (vom Boden, oder anderen Orten/Gegenständen) macht und auf der Platte verstreicht. Das Ziel in diesem Experiment ist es, dass man möglichst viele Bakterien anzüchtet, in der Hoffnung dass sich ein Sporenbildner darunter befindet. Die beimpften Platten werden im Dunkeln gelagert und nach 2 bis 3 Tagen kann man in der Regel Kulturen erkennen und verwenden.

Wenn man die Lösungen nicht lagern hat, beginnt man zweckmäßig damit, sich die später benötigten Lösungen herzustellen.

a) 5 % Chromsäure:
Man stellt 10 mL einer 5 % Chromsäure Lösung her, indem man 1,25 g Kaliumdichromat in 10 mL destilliertem Wasser löst und dazu 0,24 mL konzentrierte Schwefelsäure gibt.

b) Fuchsin Lösung:
Man löst in 1 mL 70 % Ethanol 0,05 g Fuchsin und füllt mit destilliertem Wasser auf 10 mL auf. Laut Vorschrift verwendet man eine Carbolfuchsin-Lösung, die Färbung gelingt aber ohne Phenol Zugabe genauso. Die Lösung ist prinzipiell haltbar, muss aber immer wieder filtriert werden, vor allem wenn sie länger gelagert wird.

c) Löfflers Methylenblau:
In 30 ml 70 % Ethanol löst man 0,6 g Methylenblau, gibt danach 100 mL destilliertes Wasser hinzu und 1 mL einer 1 % Kalilauge. Die Lösung ist problemlos und in geschlossenen Gefäßen lange haltbar.


Identifizierung einer geeigneten Kolonie:

Jetzt muss man die einzelnen Kolonien untersuchen und herausfinden, ob sich Sporen gebildet haben. Zuerst bereitet man einen Objektträger vor, indem man einen kleinen Tropfen der Kochsalzlösung aufbringt. Danach glüht man die Präpariernadel aus, lässt sie abkühlen, öffnet die Petrischale seitlich, und fährt damit in die Kolonie. Danach streicht man die Spitze der Präpariernadel in der Kochsalzlösung auf dem Objektträger aus und verteilt so die Bakterien. Man verstreicht die Lösung, sodass ein dünner Film am Objektträger zurückbleibt, den man eintrocknen lässt. Die Präpariernadel wird danach in der Bunsenbrennerflamme ausgeglüht, bevor man die nächste Kolonier verwendet. Der so gewonnene Ausstrich wird hitzefixiert. Dazu wird er Objektträger mit dem Ausstrich nach oben 2 mal, zügig durch die Flamme des Bunsenbrenners geführt. Man bleibt nicht mit dem Objektträger in der Flamme stehen!
Nun werden die Bakterien gefärbt. Dazu kann man mit Löfflers Methylenblau arbeiten. Der hitzefixierte Ausstrich wird 30 Sekunden mit Löfflers Methylenblau überschichtet und danach mit Wasser abgewaschen. Danach wird der Ausstrich getrocknet und man bringt einen Tropfen Immersionsöl auf und mikroskopiert unter Ölimmersion bei 1000x Vergrößerung. Endosporen erkennt man ausschließlich in Bazillen. Bazillen sind stäbchenförmig geformte Bakterien. Man erkennt sie daran, dass der Bazillus eine ungefärbte Stelle beinhaltet.
Alternativ kann man auch eine Gram-Färbung durchführen, nur gram positive Bazillen bilden Endosporen.


Endosporenfärbung:

Wie oben beschrieben stellt man von der geeigneten Kolonie einen Ausstrich her und hitzefixiert. Danach überschichtet man den Ausstrich für 5 Minuten mit einigen Tropfen 5 % Chromsäure Lösung. Danach wäscht man die Chromsäure gut ab, ungefähr eine Minute und lässt den Ausstrich trocknen. Im Anschluss überschichtet man den Ausstrich mit einigen Tropfen Fuchsin Lösung und zieht den Objektträger immer wieder durch die Bunsenbrennerflamme und erhitzt ihn so. Die Lösung sollte nicht kochen, aber dampfen und darf nicht eindampfen. Bevor die Lösung eindampft, tropft man neue nach. Man erhitzt den Ausstrich für 2 Minuten, indem man abwechseln kurz erhitzt und dann wieder abkühlen lässt. Danach wäscht man mit Wasser ab und überführt den Objektträger für wenige (!) Sekunden in eine 2 % Schwefelsäure. Dabei löst sich überschüssiges Fuchsin ab. Sofort danach wird der Objektträger mit Wasser gespült und für 2 Minuten in Wasser eingestellt, um überschüssige Schwefelsäure sicher zu entfernen. Jetzt sollten die Endosporen gefärbt sein und die restlichen Bakterien entfärbt. Nun muss man Gegenfärben. Dafür verwendet man Löfflers Methylenblau Lösung. Die Gegenfäbrung sollte sehr zart ausfallen, da man sonst die dunkelroten Endosporen schwerer erkennt. Zu diesem Zweck wird die Methylenblau Lösung 1:1 verdünnt, indem man einen tropfen Wasser auf den Ausstrich aufbringt und dann einen Tropfen Methylenblau. Dann schwenkt man den Objektträger vorsichtig, damit sich die Methylenblau Lösung gut vermischt. Die Einwirkzeit sollte 15 Sekunden nicht überschreiten. Man bricht die Färbung ab, indem man mit Wasser abwäscht. Dann lässt man den Objektträger trocknen und mikroskopiert unter Ölimmersion. Die Bakterien sollten zartblau gefärbt sein und die Endosporen, kräftig dunkelrot. Sollte die Methylenblau Färbung zu schwach ausgefallen sein, kann man das Immersionsöl entfernen, indem man den Objektträger mit Diethylether oder Petrolether spült und wie oben beschrieben nachfärbt.


Entsorgung:

Außer der Chromsäure können alle Lösungen verdünnt und neutralisiert dem Abwasser beigegeben werden. Die abgewaschene Chromsäure Lösung reduziert man mit Natriumdisulfit, oder Ascorbinsäure zu Chrom(III) und gibt sie dem Schwermetallabfall bei.


Erklärung:

Endosporen sind die Überdauerungsformen der Bakterien. Sie werden innerhalb der Bakterien Zelle gebildet. Den Vorgang der Endosporenbildung nennt man Sporulation. Unter ungünstigen Lebensbedingungen sind manche Spezies in der Lage, Endosporen auszubilden. Nur gram positive Bakterien sind dazu in der Lage. Endosporen besitzen sehr dicke Wände, weshalb sie nicht ohne weiteres angefärbt werden. Der besondere Wandaufbau erlaubt es den Endosporen selbst drastische Umweltbedingungen eine lange Zeit zu überdauern. Werden die Umweltbedingungen wieder günstiger, keimt die Endospore auf und bildet wieder ein völlig funktionsfähiges Bakterium.

Bei dem von mir gefundenen Bakterium handelt es sich um einen gram positiven, Katalase positiven Bazillus. Genauer kann ich ihn nicht klassifizieren, ich tippe aber auf Bacillus megaterium, oder Bacillus subtilis. Beide sind harmlose Keime die ubiquitär vorkommen.


Bilder:


Punktion einer Kolonie; dabei die Petrischale nur einen Spalt öffnen.



Endosporen in der Gram Färbung; man erkennt die aufgehellte Stelle in den Bazillen sehr gut; Ölimmersion 1000x.



Überschichten des Ausstrichs mit Chromsäure.



Färben mit Fuchsin.



Gegenfärbung mit Methylenblau.



Ergebnis der Färbung. Man erkennt die zartblau gefärbten Bazillen und die dunkelrot gefärbten Endosporen; Ölimmersion 1000x.


Quelle:

Bruno P. Kremer: Das große Kosmos Buch der Mikroskopie, 3. Auflage, Stuttgart 2015; Franckh-Kosmos Verlags-GmbH & Co. KG, S. 51-52
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NI2
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Sehr schöner Artikel! Bitte noch angeben welches Agar verwendet wurde, idealerweise die Inkubationstemperatur. "mL" statt "ml" und lateinische Bezeichnungen von Organismen kursiv. Man kann noch kurz gleich den Hinweis geben, dass die OT zerspringen wenn man sie zu lange in die Flamme hält (ich musste auch erst durch diese Erfahrung herausfinden warum man das nicht machen darf Very Happy). Zur Reduktion von Chrom(VI) im Sauren eignen sich nahezu alle Reduktionsmittel und auch kurzkettige Alkohole (macht die Entsorgung für den ein oder anderen evtl einfacher). Bildbeschreibung nicht kursiv und direkt unter das Bild. Ich würde mir auch noch eine Erklärung wünschen warum es mit Cr(VI) möglich ist, die Endosporen zu färben. Wie funktioniert die Färbung? Im Idealfall vom letzten Bild noch einen Ausschnitt im Querformat posten, durch die automatische Skalierung des Forums erkennt man die Endosporen nur recht schwach, aber dein Originalbild sollte durch eine Auflösung ein viel besseres Bild ermöglichen. Bei der Quelle bitte noch Auflage (und Jahr) und im Idealfall Seitenzahl angeben sofern es sinnvoll ist (es muss für den Leser exakt klar werden, welches Buch benutzt wurde, so dass er es beim ersten Suchen direkt findet, das spart eine Menge Frust).

Ansonsten gefällt mir das ganze sehr gut und ich hoffe, dass wir endlich mal dazu kommen die Schmiede aufzuräumen, da dort bereits ein paar coole Sachen von dir schlummern! Hast du vor mehr in Richtung Mikroskopie zu machen?

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Alf
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Zum Agar kann ich leider keine weiteren Angaben machen, da ich den nicht spezifisch hergestellt habe und die genaue Zusammensetzung nicht mehr weiß, es gibt aber bereits einen guten Artikel im Forum wie man einen ansetzt. Inkubiert habe ich bei Zimmertemperatur für 3 Tage.

Über die genaue Rolle der Chromsäure konnte ich nichts finden. Ich vermute, dass sie die dicke Wand der Endospore zersetzt, aber das würde nur begrenzt Sinn machen, denn dann könnte sich die Endospore ja auch in der Schwefelsäure wieder entfärben, wie der Rest der Bakterien. Eine gebräuchlichere Färbung benutzt Malachitgrün, ohne Chromsäure. Eventuell wäre die Färbung auch ohne Chromsäure möglich, das müsste man probieren. Ich habe die Kultur nur leider schon verworfen und komme frühestens Anfang Februar wieder zu Experimenten, aber es wäre einen Versuch wert.

Zitat:
Hast du vor mehr in Richtung Mikroskopie zu machen?

Berufsmäßig weiß ich es noch nicht, aber ich mikroskopiere sehr gerne und es ist ein cooles Hobby! Smile
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NI2
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Okay, es würde ja schon grob helfen was es für ein Agar war - da ich aktuell eher Pilze auf Agar kultiviere, kenne ich z.B. keine Zusammensetzung von Bakterienagar. Aber dann wäre es sehr sinnvoll auf den Artikel von iTim (wenn ich mich recht erinnere) zu verlinken in dem viele Agarrezepte stehen.

Mir ist auch nicht ganz klar wie genau die Chromsäure hier wirkt, aber ich denke da könnten lemmi, Newclears oder iTim noch etwas zu beitragen.

Okay. Ich bleibe gespannt. Ich würde in die Richtung glaube auch mehr machen, wobei ich kein großer freund von Bakterien bin und lieber bei meinen Hyphen bleibe, die sind lieb - auch wenn der ein oder andere Schimmelpilz meine Platten besiedelt hat.

Und danke für das Umsetzen der Änderungen, jetzt kann man auf dem letzten Bild die Endosporen auch viel besser erkennen!

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Alf
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Der Agar ist soetwas wie eine Eigenkreation, die natürlich sonst völlig ungeeignet ist Laughing . Ich habe eine kleine Menge Rindfleisch gekocht für 30 Minuten ungefähr in 200 mL Wasser. Dazu wurde danach nach Augenmaß etwas Glucose, Fructose, ein Schuss Milch, etwas Salz, eine Spatelspitze Kaliumnitrat, Eisensulfat, Magnesiumchlorid, Kaliumhydrogenphosphat gegeben und 2,5 g Haushaltsagar.
Ich habe auch nicht wirklich steril gearbeitet, da ich ohnehin möglichst viele Keime auf meiner Platte haben wollte. Wie gesagt für jede sinnvolle Anwendung ist dieses "Rezept" wahrscheinlich eher unbrauchbar, aber für solche Amateur Experimente reicht es allemal. Very Happy
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NI2
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Alf hat Folgendes geschrieben:
Wie gesagt für jede sinnvolle Anwendung ist dieses "Rezept" wahrscheinlich eher unbrauchbar [...]


Das mag sein. Aber wenn eben jemand das Ganze ohne viel Ahnung nachmachen will hilft das viel! Von daher sollte man das ruhig erwähnen. Auch wenn sich "Profis" dabei die Stirn runzeln Very Happy Oder zumindest angeben was für eine "Art" von Agar verwendet wurde (Habe da aber zu wenig Erfahrung diese Mischung jetzt einzuordnen).

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Pok
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Alf hat Folgendes geschrieben:
Über die genaue Rolle der Chromsäure konnte ich nichts finden. Ich vermute, dass sie die dicke Wand der Endospore zersetzt

Sie macht sie zumindest durchgängiger für den Farbstoff. Das nennt man Mazeration. Vielleicht werden irgendwelche Polymere der Sporenwand aufgespalten? Alternativen zur Chromsäure sind Chlorzinkiod-Lösung oder Wasserstoffperoxid, die etwas milder sind und wo die Mazeration etwas länger dauert (Quelle).

Die Chromsäure in der Chemikalienliste sollte man durch Kaliumdichromat austauschen.

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NI2
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Sorry, dass ich dich in der obigen Liste vergessen habe zu erwähnen. Immerhin zauberst du ja immer magische Sachen aus deinem Zylinder. Embarassed

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Pok
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Kein Problem. Mr. Green Diese spezielle Färbemethode hat übrigens auch einen Namen: die Möller-Färbung. Zumindest sind die wesentlichen Reagenzien dieselben.

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Wieder mal ein sehr schöner Artikel zu einer mikroskopischen Färbetechnik! Und tolle Fotos!

Soweit ich mich erinnere ist Bacillus subtilis die vorherrschende Spezies in einem Heuaufguss. Da könnte man - ohne die Notwendigkeit Agarplatten benützen zu müssen - an sporenbildende Bacillen kommen.

Eine andere sporenbildende Bakterienart, die sehr leicht zu züchten ist (habe ich mal als Student gemacht) ist Clostridium butyricum, ein strikter Anaerobier. Die Anzucht ist denkbar einfach. Man nimmt eine kleine Kartoffel, an der noch Erdreste hängen, sticht mit einem scharfen Messer mehrfach duch die schmutzige Schale in das Innere, legt die Kartoffel dann in ein großes Weckglas und bedeckt mehrere cm hoch mit ausgekochtem (und natürlich wieder abgekühltem) Wasser. Nach ein bis zwei Wochen ist das Innere zu einem nicht eben lecker riechenden Brei zersetzt, der massenhaft Buttersäurebazillen enthält.

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"Alles sollte so einfach wie möglich gemacht werden. Aber nicht einfacher."(A. Einstein 1871-1955)

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Alf
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Danke Lemmi für den Tipp den ich natürlich sofort ausprobieren!

Eine noch mit Erdresten verschmutzte Kartoffel wird seitlich mehrfach mit einem Messer angestochen, und mit Wasser übergossen. Das Wasser wird vorher Kurz zum Sieden erhitzt und dann lässt man es abkühlen. Es wurde ein altes, sauberes Marmeladenglas verwendet, das auch noch locker (!) verschlossen wurde. Das ganze lässt man 2 Wochen bei Zimmertemperatur stehen. Schon nach wenigen Tagen trübt sich das Wasser. Mit der Zeit entwickelt sich Gas und ein unangenehmer Geruch. Nach 2 Wochen wurde das Glas geöffnet. Auf Grund der Geruchsbelästigung im Freien. Das Wasser wurde abgegossen und die Schale Kartoffel vorsichtig aufgestochen. Die Kartoffel war völlig zersetzt und verflüssigt. Von dieser Flüssigkeit wurden nun mit einem Glasstab als Tupfer, kleine Tropfen auf Objektträger übertragen und etwas verstrichen, sodass sich ein Film bildet. Den Film lässt man trocknen und verfährt damit wie im Experiment geschildert.

Unter diesen weitestgehend anaeroben Bedingungen wachsen viele verschiedene Bakterien, unter anderem Clostridium butyricum. Clostridium butyricum ist ein gram positives stäbchenförmiges Bakterium, das die für Clostridien typischen Endosporen bildet, die durch ihre terminale Lage an Stielhandgranaten erinnern.



Methylenblau Färbung; man erkennt Clostridium butyricum in der Bildmitte, als Stäbchen mit terminal gelegenen Endosporen, die ihnen die typische Form verleihen.



Gram Färbung; die übrige Bakterien Flora, die bei dieser Methode entsteht ist überwiegen gram negativ.



Gram Färbung



Endosporen Färbung


Dadurch dass ich die Fotos aufnehme, indem ich durchs Okular fotografiere, werden sie leider nicht so schön wie es in der Realität aussieht.
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Freut mich, daß es geklappt hat!

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Bakterielle Endosporen
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