Bakterielle Endosporen

Endosporen sind die Überdauerungsformen von Bakterien. Endosporen werden bei konventionellen Färbungen nicht angefärbt. Mit Hilfe der hier vorgestellten Methode kann man sie spezifisch anfärben und so nachweisen.


Geräte:

Objektträger, Pipetten, Deckglas, Mikroskop, Präpariernadel, Bechergläser, Bunsenbrenner, Waage, Agarplatte, 1 ml Spritze


Chemikalien:

Kaliumdichromat (C, N, O, T, Xn)


Schwefelsäure 96 % (C)


Schwefelsäure 2 % (C)


Fuchsin (Xi, Xn)


Ethanol 96 % (F, Xi)


Methylenblau (Xi)


Kalilauge 1 % (C)


Bakterienkultur

0,9 % Kochsalzlösung

Aqua dest.

Immersionsöl


Hinweis:

Vorsicht beim Umgang mit carcinogenen Chrom(VI)-Verbindungen! Die hergestellten Farbstofflösungen färben auch Gewand hervorragend. Die angezüchteten Bakterien sind normale Umgebungskeime und in der Regel geht von ihnen keine Gefahr aus, trotzdem sollte man hygienisch arbeiten!


Durchführung:

Die Bakterien gewinnt man am einfachsten durch Anzüchten auf einer Agarplatte, die man entweder kauft, oder selbst gießt. Man beimpft die Platte, indem man sie einfach der Luft aussetzt, oder mit einem Wattestäbchen Abstriche (vom Boden, oder anderen Orten/Gegenständen) macht und auf der Platte verstreicht. Das Ziel in diesem Experiment ist es, dass man möglichst viele Bakterien anzüchtet, in der Hoffnung, dass sich ein Sporenbildner darunter befindet. Die beimpften Platten werden im Dunkeln gelagert und nach 2 bis 3 Tagen kann man in der Regel Kulturen erkennen und verwenden.

Wenn man die Lösungen nicht lagern hat, beginnt man zweckmäßig damit, sich die später benötigten Lösungen herzustellen.

a) 5 % Chromsäure:
Man stellt 10 mL einer 5 % Chromsäure Lösung her, indem man 1,25 g Kaliumdichromat in 10 mL destilliertem Wasser löst und dazu 0,24 mL konzentrierte Schwefelsäure gibt.

b) Fuchsin Lösung:
Man löst in 1 mL 70 % Ethanol 0,05 g Fuchsin und füllt mit destilliertem Wasser auf 10 mL auf. Laut Vorschrift verwendet man eine Carbolfuchsin-Lösung, die Färbung gelingt aber ohne Phenol Zugabe genauso. Die Lösung ist prinzipiell haltbar, muss aber immer wieder filtriert werden, vor allem wenn sie länger gelagert wird.

c) Löfflers Methylenblau:
In 30 ml 70 % Ethanol löst man 0,6 g Methylenblau, gibt danach 100 mL destilliertes Wasser hinzu und 1 mL einer 1 % Kalilauge. Die Lösung ist problemlos und in geschlossenen Gefäßen lange haltbar.


Identifizierung einer geeigneten Kolonie:

Jetzt muss man die einzelnen Kolonien untersuchen und herausfinden, ob sich Sporen gebildet haben. Zuerst bereitet man einen Objektträger vor, indem man einen kleinen Tropfen der Kochsalzlösung aufbringt. Danach glüht man die Präpariernadel aus, lässt sie abkühlen, öffnet die Petrischale seitlich, und fährt damit in die Kolonie. Danach streicht man die Spitze der Präpariernadel in der Kochsalzlösung auf dem Objektträger aus und verteilt so die Bakterien. Man verstreicht die Lösung, sodass ein dünner Film am Objektträger zurückbleibt, den man eintrocknen lässt. Die Präpariernadel wird danach in der Bunsenbrennerflamme ausgeglüht, bevor man die nächste Kolonier verwendet. Der so gewonnene Ausstrich wird hitzefixiert. Dazu wird er Objektträger, mit dem Ausstrich nach oben, 2 mal zügig durch die Flamme des Bunsenbrenners geführt. Man bleibt nicht mit dem Objektträger in der Flamme stehen!
Nun werden die Bakterien gefärbt. Dazu kann man mit Löfflers Methylenblau arbeiten. Der hitzefixierte Ausstrich wird 30 Sekunden mit Löfflers Methylenblau überschichtet und danach mit Wasser abgewaschen. Danach wird der Ausstrich getrocknet. Man bringt einen Tropfen Immersionsöl auf und mikroskopiert unter Ölimmersion bei 1000x Vergrößerung. Endosporen erkennt man ausschließlich in Bazillen. Bazillen sind stäbchenförmig geformte Bakterien. Man erkennt sie daran, dass der Bazillus eine ungefärbte Stelle beinhaltet.
Alternativ kann man auch eine Gram-Färbung durchführen. Nur grampositive Bazillen bilden Endosporen.


Endosporenfärbung:

Wie oben beschrieben stellt man von der geeigneten Kolonie einen Ausstrich her und hitzefixiert. Danach überschichtet man den Ausstrich für 5 Minuten mit einigen Tropfen 5 % Chromsäure Lösung. Danach wäscht man die Chromsäure gut ab, ungefähr eine Minute, und lässt den Ausstrich trocknen. Im Anschluss überschichtet man den Ausstrich mit einigen Tropfen Fuchsin Lösung und zieht den Objektträger immer wieder durch die Bunsenbrennerflamme und erhitzt ihn so. Die Lösung sollte nicht kochen (aber dampfen) und darf nicht eindampfen. Bevor die Lösung eindampft, tropft man neue nach. Man erhitzt den Ausstrich für 2 Minuten, indem man abwechselnd kurz erhitzt und dann wieder abkühlen lässt. Danach wäscht man mit Wasser ab und überführt den Objektträger für wenige (!) Sekunden in eine 2%ige Schwefelsäure. Dabei löst sich überschüssiges Fuchsin ab. Sofort danach wird der Objektträger mit Wasser gespült und für 2 Minuten in Wasser eingestellt, um überschüssige Schwefelsäure sicher zu entfernen. Jetzt sollten die Endosporen gefärbt sein und die restlichen Bakterien entfärbt. Nun muss man gegenfärben. Dafür verwendet man Löfflers Methylenblaulösung. Die Gegenfäbrung sollte sehr zart ausfallen, da man sonst die dunkelroten Endosporen schwerer erkennt. Zu diesem Zweck wird die Methylenblau Lösung 1:1 verdünnt, indem man einen Tropfen Wasser auf den Ausstrich aufbringt und dann einen Tropfen Methylenblau. Dann schwenkt man den Objektträger vorsichtig, damit sich die Methylenblau Lösung gut vermischt. Die Einwirkzeit sollte 15 Sekunden nicht überschreiten. Man bricht die Färbung ab, indem man mit Wasser abwäscht. Dann lässt man den Objektträger trocknen und mikroskopiert unter Ölimmersion. Die Bakterien sollten zartblau gefärbt sein und die Endosporen kräftig dunkelrot. Sollte die Methylenblau-Färbung zu schwach ausgefallen sein, kann man das Immersionsöl entfernen, indem man den Objektträger mit Diethylether oder Petrolether spült, und wie oben beschrieben nachfärben.


Entsorgung:

Außer der Chromsäure können alle Lösungen verdünnt und neutralisiert dem Abwasser beigegeben werden. Die abgewaschene Chromsäurelösung reduziert man mit Natriumdisulfit oder Ascorbinsäure zu Chrom(III) und gibt sie dem Schwermetallabfall bei.


Erklärung:

Endosporen sind die Überdauerungsformen der Bakterien. Sie werden innerhalb der Bakterienzelle gebildet. Den Vorgang der Endosporenbildung nennt man Sporulation. Unter ungünstigen Lebensbedingungen sind manche Spezies in der Lage, Endosporen auszubilden. Nur grampositive Bakterien sind dazu in der Lage. Endosporen besitzen sehr dicke Wände, weshalb sie nicht ohne weiteres angefärbt werden. Der besondere Wandaufbau erlaubt es den Endosporen selbst drastische Umweltbedingungen eine lange Zeit zu überdauern. Werden die Umweltbedingungen wieder günstiger, keimt die Endospore aus und bildet wieder ein völlig funktionsfähiges Bakterium.

Bei dem von mir gefundenen Bakterium handelt es sich um einen grampositiven, Katalase-positiven Bazillus. Genauer kann ich ihn nicht klassifizieren, ich tippe aber auf Bacillus megaterium, oder Bacillus subtilis. Beide sind harmlose Keime die ubiquitär vorkommen.


Bilder:


Punktion einer Kolonie; dabei die Petrischale nur einen Spalt öffnen.



Endosporen in der Gram Färbung; man erkennt die aufgehellte Stelle in den Bazillen sehr gut; Ölimmersion 1000x.



Überschichten des Ausstrichs mit Chromsäure.



Färben mit Fuchsin.



Gegenfärbung mit Methylenblau.



Ergebnis der Färbung. Man erkennt die zartblau gefärbten Bazillen und die dunkelrot gefärbten Endosporen; Ölimmersion 1000x.


Quelle:

Bruno P. Kremer: Das große Kosmos Buch der Mikroskopie, 3. Auflage, Stuttgart 2015; Franckh-Kosmos Verlags-GmbH & Co. KG, S. 51-52