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Auftauen, Vermehren und Auftauen von Bakterien/Hefen
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Guten Tag

Für ein Projekt muss ich Zellen von S. cerevisiae und E. coli auftauen, vermehren und wieder einfrieren. Und hätte da nun einige Fragen.

Ich habe sehr viele unterschiedliche Protokolle für Säugerzellen gefunden, aber für Bakterien und Hefen nicht wirklich viel. Der Einfrierprozess mit Glycerin sollte kein Problem sein, aber über das Auftauen kann ich nichts finden. Muss ich da wie bei den Säugerzellen etwas beachten oder kann ich die einfach bei Raumtemperatur auftauen lassen? Hat da jemand entsprechende Protokolle dazu?

Bei vielen Protokollen steht geschrieben, man solle z.B. E. Coli in der exponentiellen Phase ins Kryo-Röhrchen zum Einfrieren überimpfen. Wie kann ich in einer Flüssigkultur feststellen (ohen die Kurve aufzuzeichnen in einem Vorversuch), ob sich meine Bakterien in einer exponentiellen Phase befinden? Geht das über die OD oder sind das zeitliche Erfahrungswerte bei bestimmten Kultivierungsbedingungen?

Wie muss ich vorgehen um die Kultur aus einem Kryo zu vermehren? Soll ich diese auf eine Platte ausstreichen oder in einem Schüttelkolben anreichern?

Vielen Dank schon im Voraus für Eure Hilfe und liebe Grüsse

Angela
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E. coli und S. cerevisiae einfach bei Raumtemperatur oder Brutschrank/Wasserbad auftauen. Zur Sicherheit kannst du sie natürlich auch langsam auf Eis auftauen, vllt besser wenn sie aus -80 °C kommen.
Ansonsten muss man nichts besonderes beachten, die sind beide wesentlich unempfindlicher als Säugerzellen.

Zitat:
Bei vielen Protokollen steht geschrieben, man solle z.B. E. Coli in der exponentiellen Phase ins Kryo-Röhrchen zum Einfrieren überimpfen. Wie kann ich in einer Flüssigkultur feststellen (ohen die Kurve aufzuzeichnen in einem Vorversuch), ob sich meine Bakterien in einer exponentiellen Phase befinden? Geht das über die OD oder sind das zeitliche Erfahrungswerte bei bestimmten Kultivierungsbedingungen?


Warum so kompliziert? Wenn es trüb ist, wird wohl ausreichend gewachsen sein (wenn du Bodensatz hast, ist wohl Exp-Phase vorbei Twisted Evil ). Wenn du es genauer haben willst, gehst du einfach über OD600. Bei E. coli kann man anhand der Teilungsrate zudem die Menge gut abschätzen, auch ohne Photometer. Du musst daraus später eh wieder einzelne Kolonien gewinnen, daher gibt es dafür keinen Richtwert. Zuwenig Zellen solltest du natürlich nicht einfrieren.

Zitat:
Wie muss ich vorgehen um die Kultur aus einem Kryo zu vermehren? Soll ich diese auf eine Platte ausstreichen oder in einem Schüttelkolben anreichern?


Prinzipiell geht beides. Am sichersten ist wohl einfach eine Vorlultur in einem Kulturröhrchen. 100 µL des aufgetauten Inhalts aus dem Kryoröhrchen einfach in das 5 mL LB Medium (bzw. was du halt für Hefe nimmst) und übernacht bei 37 °C unter schütteln inkubieren. Am nächsten morgen als allererstes daraus Verdünnung austreichen. Sobald du einzelne Kolonien hast, kannst du eine entnehmen und dann damit arbeiten. Wenn deine Hefe oder dein E. coli Reistenzgene hat ist natürlich immer besser.

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