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Alcanivorax borkumensis
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Ich habe die Tage Post aus Braunschweig bekommen. Eine gefriergetrocknete Kultur von Alcanivorax borkumensis (Yakimov et al.). Es ist zwar Teil eines größeren Forschungsprojektes, aber im kleinen Rahmen werde ich die Kultivierung und Arbeit mit A. borkumensis hier beschreiben.






weiteres folgt...

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...sehr interessant!
Ich bin gespannt...

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Zu der gefriergetrockneten Probe des Bakteriums wurden 500 µL Marine-Bouillion (Link PDF) gegeben, welcher als Substrat 1 % Natriumpyruvat enthielt. Das Pellet sollte eine halbe Stunde aufquellen. Anschließend wurde ein Teil mit einer Impföse auf Marine-Agar (Bouillion + 1,5 % Agar) ausgestrichen, ein anderer Teil in Flüssig-Vorkulturen überführt. Diese wurden 48 h bei 28 °C unter schütteln inkubiert.



Nach 2 Tagen wurden mit je 100 µL der Flüssigkultur 4 Erlenmeyerkolben beimpft, in welche je 100 ml Marine-Bouillion vorgelegt waren. Der erste Kolben enthielt als Substrat 0,5 g n-Decan, der zweite 0,5 g n-Decan + 0,5 g TWEEN 80 als Emulgator (welches zuvor in Aceton gelöst wurde), als Referenz enthielt ein Erlenmeyerkolben nur TWEEN 80, der vierte weder Emulgator, noch Decan.
Die 48 h-Kultur wurde ebenfalls etwas ausplattiert.



Nach einem Tag Inkubation, wurden Stammkulturen als Referenz genommen. Die Kolben wurde nochmals 24 h inkubiert.


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Können auch andere Chemikalien als n-Decan verwendet werden?
Mfg. Tim

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Mit freundlichen Grüssen,
iTim
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Nach 48 h Inkubation, wurden Zellpellets aus den Medien abzentrifugiert. Ein Teil des Überstandes wurde mit Dichlormethan ausgeschüttelt und abzentrifugiert. Das DCM wurde in braune Vials überführt und kühl gelagert.




Das abzentrifugierte Zellpellet wurde 2 mal mit PBS-Puffer gewaschen.






Das Pellet wurde mit 3 ml MeOH versetzt und gevortext, anschließend abzentrifugiert.




Anschließend wurde das überstehende Methanol über einen Spritzenvorsatzfilter (0,45 µm Porengröße) gereinigt und in SPE-Säulen mit C-18 Reversed Phase Kieselgel überführt (https://www.carlroth.com/de/de/Chemikalien/Chromatographie/Probenvorbereitung/Standardphasen-f%C3%BCr-die-Festphasenextraktion/SPE-Polypropylens%C3%A4ulen-%3Cbr-%3ECHROMABOND%3Csup%3E%C2%AE%3C-sup%3E-C18-ec/p/000000120000817400010023_de) und dieses wieder abzentrifugiert. Zur Elution bestimmter Metaboliten wurden danach 3 mL DCM in die Säulen überführt und dieses abzentrifugiert. MeOH und DCM wurden in Vials überführt und aufbewahrt.





iTim hat Folgendes geschrieben:
Können auch andere Chemikalien als n-Decan verwendet werden?
Mfg. Tim


Freilich, A. borkumensis metabolisiert C5 bis C32 Kohlenwasserstoffe. In vielen Publikationen wird Hexadecan verwendet (z.B.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1482905/)

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Die ersten Messungen waren vielversprechend. Im Zellextrakt konnte n-Decansäure (Caprinsäure) nachgewiesen werden. Hier das Chromatogramm, ab Minuten 11 ist der Peak der Caprinsäure zusehen. Die Retentionszeit entspricht dem Standard.



Hier ist das dazugehörige MS-Spektrum. Nach NIST 93 % Übereinstimmung mit Caprinsäure.



Die Proben (und der Standard) wurden zuvor mit BSTFA derivatisiert.



Die Caprinsäure ist spezifisches Metabolit des Alkanabbaus. In Kontrollproben (wo anstatt n-Decan Na-Pyruvat verwendet wurde) konnte das Molekül nicht nachgewiesen werden.

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Pok
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Warum wird da noch diese Trimethylsilyl-Gruppe an die Säure gehängt? Sollte man nicht eher sagen, dass das ein Metabolit speziell des n-Decanabbaus und ggf. höherer Alkane ist? Beim Abbau kürzerkettiger Alkane dürfte das ja nicht entstehen. Interessant wäre noch, in welchen Teilschritten der Abbau erfolgt, d.h. in welcher Weise Enzyme am Alkan angreifen und wie die Schritte zur Carbonsäure verlaufen. Ich fände eine möglichst simple Erklärung zu den einzelnen Vorgehensweisen noch ganz wichtig. Warum die einzelnen Arbeitsschritte überhaupt durchgeführt werden, wird kaum jemand verstehen, der sich nicht mit dem Thema auskennt.
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Ich denke mal, das die Silyllierung letztlich nur eine Derivatisierung darstellt um die Probe für die GC besser geeignet zu machen.

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NI2
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Man soll bei GC-Säulen keine Fluoridionen oder Säuren drüberjagen, da diese das Säulenmatieral beschädigen. Eine zu hohe Salzlast ist ebenfalls nachteilhaft. Hier hat die Silylierung mehrere Vorteile: Man schont die Säule, senkt den Siedepunkt und verhindert eine evtl. Zwesetzung im Injektor.

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There is no sadder sight in the world than to see a beautiful theory killed by a brutal fact. [T. Huxley]

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